人参作为著名的中草药 , 在我国已经使用了几千年之久 , 据《神农本草经》记载 ：人参主补五脏 , 安精神 , 定魂魄 , 止惊悸 , 除邪气 , 明目开心益智 , 久服轻身延年。 林蛙油又称蛤蟆油、田鸡油、哈什蚂油 , 为雌性林蛙干燥的输卵管制品 , 具有补肾益精、润肺养阴之功效 , 其主要分布东北长白山区。林蛙油中含有多种生理活性物质 , 具有明显的生理保健作用。因此 , 本文采用 Ames 试验平皿掺入法对人参与林蛙油配伍的保健食品进行了体外致突变效应初步探讨 , 为其保健食品开发利用提出科学理论依据。
1材料与方法
1. 1材料
1. 1. 1试剂 人参与林蛙油配伍的保健食品 , 由本实验室自制 ;敌克松、叠氮钠、二氨基芴、1, 8- 二羟基蒽醌均购自 Sigma 公司 ;D- 生物素、L- 盐酸组氨酸购自 Fluka 公司 ;鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102和 S9 均购自上海启发实验有限公司。
1. 1. 2仪器 电热恒温培养箱、电热恒温水浴箱 , 均由上海基玮试验仪器设备有限公司产 ;立式压力蒸汽灭菌仪(YXQ-LS-50G 型 ), 上海博迅实业有限公司医疗设备厂产 ;METTLER TOLEDO-AB204-N 分析天平 , 上海产。
1. 2方法
1. 2. 1试验方法 依据《保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范》中介绍的平板掺入法进行试验。试验设5000、1000、200、40、8 g/ 皿 5 个剂量。取 2.5 g 受试物加二甲基亚砜至 50 ml 混均即为 5000 g/ 皿剂量 , 其余各受试物剂量 1/5 倍比递减稀释 ;上述受试液经灭菌 ( 时间 ：20 min,温度 ：121℃ , 压力 ：0.103 MPa) 后使用 ;另设未处理对照、溶剂对照、阳性对照。在顶层琼脂中加入 0.1 ml 试验菌株增菌液、0.1 ml 受试物溶液 , 代谢活化时加入 0.5 ml S9 混合液 ,混匀后倒入底层培养基平板上。37℃ , 培养 48 h, 计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数 2倍以上 , 并具有剂量 - 反应关系者则定为阳性。每个剂量做3 个平行。整套试验在相同条件下重复做 2 次并分别统计。
1. 2. 2 阳性对照 活化系统 TA97、TA98、TA100 采用二氨基芴 10.0 g/ 皿 , TA102 为 1, 8- 二羟基蒽醌 50.0 g/ 皿。非活化系统 TA97、TA98、TA102 为敌克松 50.0 g/ 皿 , TA100为叠氮钠 1.5 g/ 皿。
1. 3 统计学方法 采用 SPSS17.0 统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数 标准差 ( x-s) 表示 , 采用 t 检验。P0.05 表示差异具有统计学意义。
2结果
结果显示 , 将人参与林蛙油配伍的保健食品在鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株 TA97、TA98、TA100、TA102 进行平板掺入试验 , 无论在加和不加 S9 混合液时 ,8~5000 g/ 皿各剂量组均未引起试验菌株的回复突变菌落数显著增加 , 与阴性对照组比较差异无统计学意义 (P溶剂对照组的菌落回变数与阴性对照组相比差异无统计学意义 (P阳性诱变剂诱发回变菌落数均明显增加 , 与阴性对照比较差异有统计学意义 (P0.01)。
3讨论
Ames 试验是国际上通用的遗传毒理学鉴定致突变的必检项目之一。采用鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株作为微生物 , 检测化学物的致突变性。人工诱变的鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型菌株在其组氨酸操纵子中有一个突变 , 突变菌株必需以来外源性组氨酸才能生长 , 在无组氨酸的选择性培养基上不能存活 , 诱变剂可使其基因发生回复突变 , 使它在缺乏组氨酸的培养基上也能生长。另外 ,Ames 试验在安全性评价方面具有举足轻重的作用 , 应在生物安全柜中操作及观察结果 , 注意严格无菌操作 , 以保证本次试验结果的可靠性。
本试验将人参与林蛙油配伍的保健食品与各标准菌液混合后在最低营养板上培养 , 依据出现的回变菌落数及致突变比值来判断其是否存在诱变物质。结果显示 , 在有无 S9 的作用下 , 人参与林蛙油配伍的保健食品各剂量组均未发现测试菌株回变菌落数超过阴性对照组回变菌落数的 2 倍 , 且无剂量 - 反应关系 , 而阳性对照组各测试菌株的回变菌落数均明显增加 , 并超过阴性对照组回变菌落数的 2 倍以上 , 证实本实验条件下 , 鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对人参与林蛙油配伍的保健食品检测结果为阴性 , 试验结果表明 , 人参与林蛙油配伍的保健食品在 5000-8g/ 皿的剂量内无致突变性 , 为其进行功能学评价提供了科学依据。
