胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其病死率居恶性肿瘤的第2 位，发病率居恶性肿瘤第4 位，严重危害人类健康。手术是早期胃癌的首选治疗方案，但术后转移率高，五年生存率低。近年来研究发现，肿瘤微血管生成在胃癌的发生、发展、侵袭转移过程起着重要的作用。中医药以其副反应小、疗效确切，成为胃癌综合治疗的重要手段。健脾解毒方是我院肿瘤科经验方，由黄芪、白术、薏苡仁、猪苓、石见穿等组成，具有益气健脾、理气解毒的功效。我们前期临床及实验研究发现，健脾解毒方能够改善胃癌患者的生存质量、延长患者生存期，降低患者血清VEGF 表达，且对幽门螺杆菌( H. pylori) 诱发胃癌血管新生有明显的抑制作用[6-9]。本研究旨在探讨健脾解毒方对胃癌裸鼠皮下移植瘤生长和微血管生成的抑制作用。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
1. 1. 1 动物及细胞株BALB /c 裸小鼠，雄性，4～6 周龄，体质量( 18 2) g，SPF 级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号: SCXK( 沪) 2012-0002。人胃低分化腺癌MKN45 细胞株，由上海中医药大学附属曙光医院肿瘤实验室提供。
1. 1. 2 药物与试剂健脾解毒方( 由生黄芪、白术、薏苡仁、野葡萄藤、八月札等组成) ，醇提物由上海中医药大学中药学院制备及进行质量控制; 5-氟尿嘧啶( 5-Fu) ，购自齐鲁制药( 海南) 有限公司( 批号: H20093079) ; RPMI-1640 培养基和胎牛牛血清，均购自Gibco 公司; 胰蛋白酶，购自美国Sigma公司; CD34 抗体，购自美国RD 公司; 血管内皮生长因子( VEGF) ELISA 试剂盒，购自上海博谷生物科技有限公司。
1. 2 胃癌移植瘤模型建立及分组给药按照我们以前文献中报道的方法，用PBS 将人胃癌细胞制成浓度为1 107 /ml，以每只0. 2 ml 注射裸鼠腋下，建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤生长至100 ～ 300 mm3，选择符合实验标准的荷瘤鼠60 只，随机分为5 组: 即模型组、5-Fu 组及健脾解毒方低、中、高剂量组，每组12 只。健脾解毒方低、中、高剂量组分别灌胃250、500、1 000 mgkg - 1d - 1 的健脾解毒方醇提物悬浊液，每日1 次，共给药21 d; 5-Fu 组腹腔注射给药，30 mg /kg，每日1 次，共给药5 d; 模型组灌胃等体积生理盐水。
1. 3 检测项目与方法每隔2 d 测量裸鼠肿瘤大小。给药第21 天后，每组取6 只摘除眼球取血，并取出瘤体测量肿瘤大小及质量; 每组剩余6 只小鼠用于观察生存时间。
1. 3. 1 肿瘤体积、肿瘤抑制率及荷瘤鼠生命延长率的计算肿瘤体积( TV) = ab2 /2，其中a、b 分别表示肿瘤的长、短径; 瘤重抑制率= ( l - 药物干预组平均瘤重/模型组平均瘤重) 100%; 生命延长率( %) = ( T /C - 1) 100%，其中T 代表药物干预组小鼠的平均生存时间，C 代表模型组小鼠的平均生存时间。
1. 3. 2 免疫组化方法检测肿瘤组织微血管密度情况按照我们以前文献报道的方法，取瘤体组织，采用4 m 连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。将切片依次经内源性过氧化物酶清除、抗原修复、血清封闭、抗体结合、DAB 染色、蒸馏水洗涤; 再经苏木素衬染，烟酸酒精分化，稀氨水蓝化。递增梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规树脂封片。所用一抗为1 ∶ 50 稀释的CD34 抗体，二抗为1 ∶ 200 生物素标记二抗，显色时加入1 ∶ 200 辣根酶标记链霉卵白素，3种试剂均以磷酸盐缓冲液稀释。微血管密度( MVD) 计数按Weidner 法进行: CD34 阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准;切片在100 倍光镜下挑选微血管分布最高密度区域，在200 倍光镜下计数不重复视野中被CD34 染成棕黄色的微血管数，取其平均值作为MVD。每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管; 只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。
1. 3. 3 ELISA 法检测裸鼠血清VEGF 表达将经眼球静脉丛取出的小鼠全血离心后，收集血清。采用VEGF ELISA 试剂盒测定各组小鼠血清VEGF 的表达情况，具体检测方法参照试剂盒说明书进行。将检测结果用ELISA 标准曲线专用软件作出VEGF浓度的标准曲线，分别根据标准曲线计算出各检测孔中VEGF 的浓度。
1. 4 统计学方法数据以x s 表示，采用SPSS18. 0 统计软件包进行统计分析。两独立样本均数比较采用Independent-Samples T Test，多样本均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNKq检验，生存分析采用Kaplan-Meier 方法。检验以P 0. 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2. 1 对裸鼠人胃癌肿瘤生长的影响与模型组比较，各药物干预组的瘤体质量均有不同程度减轻( P 0. 01) ，其中健脾解毒方中、高剂量组在瘤体质量及抑瘤率方面均与低剂量组有显著性差异( P 0. 01) ，表明健脾解毒方能够呈剂量依赖性地抑制裸鼠人胃癌皮下移植瘤的生长，且健脾解毒方高剂量组与5-Fu 组的作用无统计学差异( P 0. 05) 。
2. 2 对胃癌裸鼠生存期的影响观察结果显示，各药物干预组荷瘤鼠中位生存时间均较模型组明显延长( P 0. 01) ，健脾解毒方低、中、高剂量和5-Fu对荷瘤鼠均有一定的生命延长作用，并且健脾解毒方中、高剂量组荷瘤鼠中位生存时间和生命延长率方面均与健脾解毒方低剂量组有显著性差异( P 0. 01) 。这表明健脾解毒方能够延长荷瘤裸鼠的生存时间，且具有一定的量效关系。 各组裸鼠荷瘤生存期比较( n = 6)
2. 3 对人胃癌荷瘤鼠MVD 和VEGF 表达的影响免疫组化及ELISA 法检测结果显示，健脾解毒方低、中、高剂量组和5-Fu 组均能显著降低MVD、下调裸鼠血清中VEGF 表达水平，与模型组比较差异均有统计学意义( P 0. 01) ; 其中健脾解毒方中、高剂量组作用明显优于健脾解毒方低剂量组( P 0. 01) 。表明健脾解毒方能够抑制裸鼠人胃癌VEGF 表达和微血管的形成，且呈一定剂量依赖性。
3 讨论
实体肿瘤无控制地侵袭性生长是恶性肿瘤的主要特征，其与肿瘤组织中新生血管的生成密切相关。肿瘤血管新生或血管生成是实体瘤生长的关键因素，而且是肿瘤细胞侵袭转移的必需条件。肿瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑制因子的两者有机调控: 一旦血管生成因子上调或血管生成抑制因子功能障碍，二者平衡被打破即发生肿瘤血管新生。
VEGF 及其相关受体是介导肿瘤组织内及周围新生血管形成的关键因素，是刺激肿瘤血管生成的最强的、特异性最高的促血管生长因子之一。VEGF与其受体结合引起受体自身磷酸化，激活丝裂原活化的蛋白激酶，增强血管内皮细胞有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成; 并能增强血管尤其是微小血管的渗透性，使血浆蛋白等大分子外渗沉积在血管外的基质中，为新生毛细血管网建立提供营养。VEGF 的高表达与肿瘤微血管密度、恶性程度、患者预后不良密切相关，VEGF 检测已广泛应用于诸多肿瘤疾病的病情评估。多项研究结果显示，VEGF 在胃癌组织的阳性表达率明显高于相应癌旁组织，并且VEGF 高表达的胃癌患者与其组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、TNM 分期密切相关。胃癌的病变过程复杂，我们经过大量临床观察和实践证实脾虚湿热蕴结是胃癌发生发展的重要原因，并提出健脾解毒的治法，代表方剂为健脾解毒方。该方由黄芪、党参、白术、薏苡仁、猪苓、石见穿等组成。黄芪补气健脾; 白术、薏苡仁、猪苓健脾利湿; 石见穿、野葡萄藤、八月札解毒理气。全方具有益气补脾、解毒利湿功效，且药简力专，驱邪不伤正，扶正不助邪。我们临床研究表明，健脾解毒方联合化疗能够改善患者临床症状，延长患者生存期，减轻化疗毒副作用，抑制胃癌术后患者复发转移率，并可显著下调肿瘤患者血清中VEGF 的表达。前期的实验研究表明，健脾解毒方可减少幽门螺杆菌诱发C57BL /6 小鼠胃癌过程中MVD，抑制VEGF、Ang-2 和Tie-2 的表达，且对结肠癌小鼠肿瘤血管新生有明显的抑制作用，这可能是其防治胃癌的重要机制之一; 体外实验也证实其可抑制H.pylori 诱导的人胃癌MKN45 细胞VEGF 表达。本研究通过建立裸鼠人胃癌移植瘤模型，研究发现健脾解毒方低、中、高剂量组均可抑制裸鼠人胃癌移植瘤生长，延长荷瘤鼠中位生存时间，与模型组比较差异有统计学意义; 健脾解毒方低、中、高剂量组血清VEGF 表达和肿瘤组织MVD 均较模型组明显降低，呈一定的剂量依赖效应。综上所述，健脾解毒方能够抑制裸鼠胃癌生长，延长生存期，其机制可能与抑制VEGF 表达进而抑制肿瘤微血管生成有关。
