白头翁汤是中医临床常用的经典方剂，由白头翁、黄连、黄柏、秦皮组成，对多种原因引起的热毒血痢有较好疗效。由于中药复方成分复杂，故制定科学合理的相关质量标准难度较大，目前大多以所含主要指标成分的含有量为依据，指标成分设定的越多，对制剂质量的评价就越准确客观，反之则科学性就越差。文献以白头翁汤中个别指标成分为标准，或者通过TLC 法进行定性，但定性鉴别只能解决各组成药材的真伪问题，对个别指标成分含有量的测定也不能全面评价该制剂的质量。本研究建立RP-HPLC 法同时测定白头翁汤中8 种指标成分( 秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4) 的含有量，旨在为该制剂质量标准的制定提供更科学的实验依据。
1 材料与仪器
1. 1 药品与试剂盐酸小檗碱( 201212) 、黄连
碱( 201112 ) 、巴马汀( 201510 ) 、表小檗碱( 201007 ) 、秦皮甲素( 201204 ) 、秦皮乙素( 201107) 和白头翁皂苷B4( 201101) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。白头翁、黄柏、黄连、秦皮均购自合肥乐家老铺中药饮片有限公司，经安徽科技学院食品药品学院时维静教授鉴定为正品。甲醇、乙腈为色谱纯( 美国J. T. Baker 公司) ; 磷酸二氢钾、十二烷基磺酸钠为色谱纯( 美国ACS 恩科化学公司) ; 磷酸为色谱纯( 美国Fisher 公司) 。
1. 2 仪器Agilent 1100 液
相色谱仪( 配置G1379A 型自动脱气机、G1311A 型四元泵、G1313A 型自动进样器、G1316 型柱温箱、G1312A型可变波长紫外检测器和色谱工作站) 、ZOBAX 色谱柱( 美国安捷伦公司) ; BSA224S 分析天平( 赛多利斯科学仪器北京有限公司) ; Genpure UV-WC实验室超纯水系统( 美国Thermo 公司) ; XH-D 涡旋振荡器( 无锡沃信仪器有限公司) 。
2 方法与结果
2. 1 标准溶液配制精密称取盐酸小檗碱1. 4 mg、表小檗碱1. 0 mg、巴马汀1. 1 mg、黄连碱1. 4 mg、黄柏碱1. 7 mg、秦皮甲素1. 3 mg、秦皮乙素1. 5 mg、白头翁皂苷B4 1. 0 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，即得。
2. 2 供试品溶液制备按药典组方及比例称取白头翁、黄柏、黄连和秦皮适量，去离子水常规水提，定容至100 mL，得白头翁汤水提液供试样品，同法制备3 批。从中吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，0. 22 m 微孔滤膜过滤，即得。
2. 3 阴性溶液制备按组方比例，制备缺白头翁、秦皮、黄连、黄柏的阴性样品。从中吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，乙腈定容，0. 22 m 微孔滤膜过滤，即得。
2. 4 流动相确定采用多波长梯度洗脱方式进行测定。考擦了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸流动相系统，将流动相B ( 乙腈) 和流动相D ( 0. 1% 磷酸，pH = 3. 7) 以不同比例梯度洗脱，得到分离度较好、时间较短的洗脱程序; 体积流量0. 7 mL /min;进样量10 柱温30 ℃。
2. 5 检测波长确定根据《中国药典》，各成分的最大吸收波长约为300 nm 左右。故本研究选择300 nm 波长，然后单独进样以逐个考察该成分出峰时间，最后确定波长变化程序。
2. 6 液相色谱条件确定梯度洗脱( 0 ～ 10 min，5% ～ 6% 乙腈; 10 ～ 15 min，6% ～ 25% 乙腈;15 ～ 45 min，25% ～ 35% 乙腈) ，检测波长315 nm( 0 ～ 18. 5 min) 、284 nm ( 18. 5 ～ 20 min) 、315 nm( 20 ～ 25 min) 、345 nm ( 25 ～ 40 min) 、210 nm( 40 ～ 60 min) ; 体积流量0. 7 mL /min; 柱温30 ℃;进样量10 L。
2. 7 HPLC 检测HPLC 色谱图。各成分保留时间分别为秦皮甲素17. 05 min、黄柏碱19. 25 min、秦皮乙素21. 52 min、表小檗碱25. 35 min、巴马汀26. 31 min、黄连碱29. 74 min、盐酸小檗碱31. 35 min、白头翁皂苷B4 42. 83 min，分离度良好，阴性无干扰。
2. 8 系统性试验
2. 8. 1 线性关系考察取标准品溶液母液各50 L，置于1. 5 mL 离心管中，氮吹仪挥干， 定容至1 mL，倍比稀释后分别得到5 个梯度的混合标准品溶液，在2. 2项色谱条件下测定。以质量浓度为纵坐标( Y) ，峰面积为横坐标( X) 进行线性回归，得到各标准物质的标准曲线，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。
2. 8. 2 精密度试验
2. 8. 2. 1 日内精密度于制备后第0、2、4、6、8、12 h 精密吸取高、中、低3 个质量浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下测定。结果，秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD 分别为0. 28% ～ 0. 41%、0. 38% ～ 0. 42%、0. 41% ～ 0. 69%、
2. 8. 2. 2 日间精密度于制备后第1、2、3、4、5 天精密吸取高、中、低3 个质量浓度的混合对照品溶液，在上述色谱条件下测定。结果，秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD 分别为0. 46% ～ 0. 73%、0. 51% ～ 0. 72%、0. 20% ～0. 61%、0. 45%～ 1. 18%、0. 42%～ 1. 03%、0. 61% ～1. 61%、0. 28% ～1. 17%、0. 43% ～ 0. 51%，表明仪器精密度良好。
2. 8. 3 重复性试验按2. 2项下方法制备供试品溶液5 份，在上述色谱条件下进样，测得秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱、白头翁皂苷B4峰面积RSD 分别为2. 12%、2. 41%、2. 09%、1. 94%、2. 17%、2. 47%、1. 82%、1. 47%，表明该方法重复性良好。
2. 8. 4 稳定性试验取同一供试品溶液，每隔4 h在上述色谱条件下测定，共6 次，测得秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4峰面积RSD 分别为0. 37%、0. 52%、0. 63%、0. 39%、0. 46%、0. 32%、1. 24%、1. 08%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2. 8. 5 加样回收率试验取各成分含有量已知的供试品6 份，每份1 mL，精密加入盐酸小檗碱( 17. 5 g) 、黄连碱( 17. 5 g) 、巴马汀( 27. 5 g) 、表小檗碱( 25 g) 、秦皮甲素( 32. 5 g) 、秦皮乙素( 37. 5 g) 、黄柏碱( 42. 5 g) 、白头翁皂苷B4( 25. 0 g) 对照品溶液，定容，在上述色谱条件下测定，计算回收率。
2. 9 含有量测定将供试品溶液于第1、3、5 天进样测定。结果，均符合药典要求( 表小檗碱、黄连碱、巴马汀以及盐酸小檗碱相对于全方的含有量分别为0. 8%、1. 6%、1. 5%、1. 6% 和5. 5%，秦皮甲素和秦皮乙素之和超过1. 0%，白头翁皂苷B4为4. 6%，黄柏碱为0. 34%) 。
3 讨论和结论
白头翁汤源自《伤寒论》，具有清热解毒、凉血止痢之功效，主治热毒痢疾，临床常用于阿米巴痢疾、细菌性痢疾等疾病的治疗，而且因其以临床疗效好、毒副作用小、在肉食品中残留少等优势，还被广泛用于动物各种细菌性、病毒性疾病的治疗。随着中药现代化发展，白头翁汤在传统汤剂的基础上推陈出新，出现了散剂、灌肠剂、结肠缓释片、颗粒剂等多种新剂型。
因此，建立一套科学完善的白头翁汤质量检测标准显得尤为必要。本实验考察了乙腈-磷酸、甲醇-磷酸、乙腈-三乙胺流动相系统对成分测定的影响，发现甲醇-磷酸、乙腈-三乙胺系统均会对测定造成干扰，推测三乙胺紫外吸收波长较大，造成负吸收，严重干扰基线，导致基线不平，从而干扰定量结果，故选择乙腈-磷酸系统，并以适量三乙胺调节pH。同时，对不同体积比例下的色谱图进行比较，发现当乙腈所占比例为50% 时，各成分保留时间均在30 min以上，分离度较差，达不到测定要求; 为30% 左右时，虽然缩短了大多数成分的保留时间，但分离度仍达不到定量要求，故最终采用梯度洗脱检测法，在此条件下各成分分离度良好，无相互干扰。本研究建立RP-HPLC 法同时测定白头翁汤中8 种指标成分( 秦皮甲素、黄柏碱、秦皮乙素、表小檗碱、巴马汀、黄连碱、盐酸小檗碱和白头翁皂苷B4) 的含有量，通过方法学考察，表明该方法准确可靠，所得各成分分离度较好，能够满足定量测定要求。
