马钱子始载于《本草纲目》，为马钱科植物马钱子StrychonsnuxvomicaL. 的干燥成熟种子。具有消肿利咽、清热解毒、通痹止痛、散热消瘀等功效，多用于治疗风湿性关节炎和神经系统疾病。但马钱子是一味代表性的大毒中药，生物活性强，且治疗剂量与中毒剂量较接近，治疗窗较为狭窄，因此限制了马钱子的广泛使用，研究并掌握马钱子主要活性成分的肠道吸收特性，有利于临床灵活地使用马钱子，通过配伍作用，使马钱子保持在治疗窗内，起到减毒增效的效果。目前，关于马钱子碱、士的宁的肠吸收特性的文献报道较少，且研究不系统。本研究采用大鼠外翻肠囊法，系统地研究不同肠段、浓度、pH、Pgp抑制剂、MRP 抑制剂及细胞紧密连接开放剂对马钱子中马钱子碱、士的宁在大鼠肠道吸收的影响。药物跨胃肠道转运吸收是口服制剂中药物传输到靶点的关键步骤，从肠段转运的角度明确马钱子中马钱子碱和士的宁肠道吸收特性，可为马钱子配伍减毒增效研究奠定生物药剂学基础，为马钱子的临床合理用药提供依据。
1 材料与方法
1. 1 试验药物
马钱子购自南昌市采购于开心人大药房，产自安徽省亳州市，药材由江西中医药大学张寿文教授鉴定为马钱子科马钱子Strychonsnuxvomica L. 的种子，经含量测定，马钱子药材中马钱子碱含量为0. 93%，士的宁含量为1. 56%，符合中国药典2015 版的标准，高效液相色谱图见图1。马钱子碱对照品( 中药固体制剂制造技术国家工程中心，批号: BCTG-0442) ;士的宁对照品( 中药固体制剂制造技术国家工程中心，批号:BCTG-0612) 。
1. 2 动物
SD 大鼠，雄性，体重( 300 20) g，江西中医药大学实验动物中心提供，合格证号: SYXK( 赣) 2014-0008。
1. 3 试剂
庚烷磺酸钠( 上海展云化工有限公司，批号:150405) ; 盐酸维拉帕米( 中国食品药品检定研究院，批号:100223-200102) ; MK-571 ( SIGMA，批号: 103M4621V) ; EDTA-2Na( Solarbio，批号: 20181125) 。
1. 4 仪器
Agilent1260 高效液相色谱仪( 美国) ，包括: 在线脱气机、四元梯度泵、柱温箱、紫外检测器; Sigma3-18K 型高速冷冻离心机( 美国Sigma 公司) ; BS124S 型电子分析天平( Sartorius公司) ; 恒温水浴锅( 品相科仪上海有限公司) 。
1. 5 方法
1. 5. 1 马钱子水提液的制备称取一定量马钱子粉，浸泡30min， 10 倍量水加热回流两次，每次1h，合并两次滤液。对马钱子水提液做含量测定，用10g 马钱子按1. 5. 1 方法提取，可得150ml 水提液，水提液中马钱子碱的浓度为688. 7g /ml，士的宁的浓度为897g /ml。
1. 5. 2 供试剂的配制
1. 5. 2. 1 K-R 液的配制称取葡萄糖1. 4g，CaCl2 0. 37g，分别用少量双蒸水溶解，再依次称取NaCl 7. 8g，KCl 0. 35g，MgCl2 0.22g，NaH2PO4 0. 22g 和NaHCO3 1. 37g，加双蒸水溶解后与已溶解的CaCl2和葡萄糖混匀，用双蒸水定容到1L，即得Krebs-Ringer液( K-R 液) ，备用。
1. 5. 2. 2 马钱子碱、士的宁相关供药体系的配制按药典马钱子人用药安全范围，换算为大鼠用药范围，在安全用药范围内，用已准备好的K-R 液配制马钱子供药体系。
1. 5. 2. 3 马钱子碱、士的宁混合对照品的配制按照2015 版药典，取士的宁对照品5. 99mg、马钱子碱对照品5. 02mg，精密称定，分别置10ml 容量瓶中，加三氯甲烷适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2ml，置同一10ml 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
1. 5. 3 色谱条件色谱柱: Kromasil100-5 C18 色谱柱( 250mm 4. 6mm，5 流动相: 乙腈-0. 01mol /L 庚烷磺酸钠与0.02mol /L 磷酸二氢钾等量混合溶液( 用10% 磷酸调节pH 至2.8) ( 21: 79) ，检测波长为260nm，进样量为10l，柱温为25℃。
1. 5. 4 马钱子碱、士的宁方法学考察
1. 5. 4. 1 分析方法专属性考察分别取空白肠囊液、马钱子碱和士的宁混合对照品、含马钱子碱和士的宁混合对照品的空白肠囊液、肠囊液样品10l 进行HPLC 检测，考察空白肠囊液对出峰时间是否有干扰。
1. 5. 4. 2 标准曲线的制备精密吸取已配制好的马钱子碱、士的宁混合对照品溶液，分别配制成一系列浓度的混合对照品溶液，各取10l 进行HPLC 检测。
1. 5. 4. 3 加样回收率试验精密量取已知浓度的肠囊液样品，分别精密加入高、中、低浓度的马钱子碱、士的宁混合对照品，充分混匀，各取10l 进行HPLC 测定。
1. 5. 4. 4 稳定性取同一肠囊液样品于室温0、2、4、8、12、24h 分别取10l 进行HPLC 检测。
1. 5. 4. 5 精密度同一份马钱子碱、士的宁混合对照品溶液中，重复取样6 次，分别取10l 进行HPLC 检测。
1. 5. 5 外翻肠囊模型大鼠禁食过夜( 自由饮水) ， 10% 的水合氯醛( 3. 4ml /kg) 腹腔注射。沿大鼠腹中线切开，分别剪下十二指肠( 距胃幽门1cm 处开始量取10cm) 、空肠( 距胃幽门15cm 处开始量取10cm) 、回肠( 距盲端20cm 处开始量取10cm) 、结肠( 紧邻盲肠端至直肠量取10cm) ，用冰冷的K-R 液洗净肠内容物，去除肠系膜，用毛细管将肠道翻转使黏膜面朝外，将生理下端用细线扎紧，另一端绑扎于取样口，用注射器从取样口向肠囊内注满空白K-R 液2ml，作为受药体系。将整个装置于37℃水浴锅中进行实验1h。实验结束后，将肠囊取出，放入冰冷的K-R 液中清洗2 次，洗去肠黏膜上吸附的药液，收集肠囊液，并测量肠内径及长度，收集所得肠囊液以转速10000rpm 离心10min 后，上清液过0. 22 微孔滤膜，取10l 进行HPLC 检测。考察不同肠段、浓度、pH、P-gp 抑制剂、MRP 抑制剂、细胞间紧密连接开放剂对马钱子中马钱子碱和士的宁在大鼠肠吸收的影响。
1. 5. 6 数据处理各组Papp 按以下公式计算，对各组间的显著性比较采用统计学软件SPSS21. 0 进行比较，数据采用x s表示。Papp = dQ /dtA C0Papp 为化合物的表观渗透系数，dQ/dt 为单位时间内药物转运量，C0为供液体系中药物的浓度( mg /L) ，A 为肠面积( cm2 ) 。
2 结果
2. 1 方法学考察结果
2. 1. 1 专属性实验结果空白肠囊液、马钱子碱和士的宁混合对照品、含马钱子碱和士的宁混合对照品的空白肠囊液、肠囊液样品检测结果如图2( 马钱子碱出峰时间为15. 16min，士的宁出峰时间为18. 05min) 。由图可知: 空白肠囊液、马钱子碱和士的宁混合对照品、含马钱子碱和士的宁混合对照品的空白肠囊液、肠囊液样品特征峰的出峰时间一致，空白肠囊液对出峰时间无干扰，证明此方法可靠。
2. 1. 2 标准曲线以马钱子碱、士的宁峰面积( Y1，Y2) 对马钱子碱、士的宁浓度( X1，X2) 进行回归，分别得到马钱子碱回归方程Y1 = 7. 7732X1 + 0. 81( R2 = 1) ，士的宁回归方程Y2 = 9.1831X2 + 1. 4338 ( R2 = 1) ，结果表明马钱子碱在3. 124 ～100g /ml 线性关系良好，士的宁在3. 25 ～ 120g /ml 线性关系良好。
2. 1. 3 加样回收率计算高、中、低浓度的马钱子碱和士的宁对照品的回收率，马钱子碱平均回收率为98. 3%，RSD 为3.12%; 士的宁平均回收率为103. 03%，RSD 为1. 89%。
2. 1. 4 精密度精密度峰面积RSD 为0. 9%，表明仪器的精密度良好。
2. 1. 5 稳定性稳定性实验峰面积RSD 为1. 23%，表明样品在24h 内稳定性良好。
2. 2 不同肠段对马钱子中马钱子碱和士的宁肠吸收的影响配制pH 为7. 4、生药浓度为2. 53g /L ( 马钱子碱浓度为17.93ug /ml，士的宁浓度为26. 33ug /ml) 的马钱子供药体系，分别取不同肠段进行外翻肠囊实验，结果见表1 和表2。由表可知马钱子中马钱子碱和士的宁在各肠段均有吸收，在回肠和结肠的吸收较好。鉴于以上结果，选取小肠中的回肠肠段进行其他因素的考察。
2. 3 药物浓度对马钱子中马钱子碱和士的宁肠吸收的影响研究在pH 为7. 4 条件下，1. 52、2. 28、3. 03、4. 55、6. 07g /L( 马钱子碱浓度分别为: 16. 47、24. 71、32. 94、49. 42、65. 88ug /ml; 士的宁浓度分别为: 22. 20、33. 30、44. 40、66. 61、88. 81ug /ml) 这5 个生药浓度的马钱子供药体系对马钱子碱、士的宁的肠吸收影响( 每个浓度取5 只大鼠进行实验) ，结果见表3 和表4，由表可知在不同浓度条件下，马钱子碱和士的宁的表观渗透系数无显著性差异，说明药物吸收在肠道内无饱和现象，符合Ficks 扩散原理，故可推测马钱子碱、士的宁的吸收机制可能以被动扩散为主。
2. 4 不同pH 对马钱子中马钱子碱和士的宁肠吸收的影响
研究生药浓度为2. 08g /L( 马钱子碱浓度为22. 54ug /ml，士的宁浓度为30. 38ug /ml) 不同pH( 7. 4、6. 8 和5. 0) 的供药体系对马钱子碱、士的宁的肠吸收影响，结果见表5，由表可知在不同pH条件下，马钱子碱和士的宁在pH = 7. 4 条件下，吸收情况最好。
2. 5 P-gp 抑制剂对马钱子中马钱子碱、士的宁肠吸收的影响
用K-R 液稀释马钱子水提液配制马钱子组供药体系( 生药浓度为2. 08g /L，马钱子碱浓度为22. 54ug /ml，士的宁浓度为30.38ug /ml) ，称取维拉帕米( Ver) 适量置100ml 容量瓶中，用已配制好的马钱子供药体系定容，配制成马钱子-维拉帕米组供药体系( 100mol /L) 。取回肠肠段，进行外翻肠囊实验。由表可知Ver 能显著增加马钱子碱及士的宁的吸收，暗示马钱子碱和士的宁可能是P-gp 的底物。
3 讨论
口服吸收良好的药物，其Papp 大于1 10-6 cm/s; 吸收较差的药物，其Papp 小于1 10-7 cm/s; 介于两者之间的为中等吸收。本研究通过大鼠外翻肠囊法发现马钱子中马钱子碱、士的宁在整个肠段皆有吸收，两者在各肠道吸收为: 回肠结肠空肠 十二指肠。且马钱子碱和士的宁的Papp 均大于1 10-6cm/s，故马钱子中马钱子碱和士的宁的口服吸收良好，这与文献报道一致。
pH 值会影响药物在胃肠道的吸收，在禁食状态下，胃幽门以下十二指肠处pH 陡升到4. 6 左右，从近端空肠到远端回肠，pH 由大约6 逐渐上升到8，结肠pH 为7 ～ 8，因此本实验考察了马钱子碱、士的宁在pH 为5. 0、6. 8、7. 4 环境下的肠吸收情况。通过实验结果可知马钱子中马钱子碱、士的宁在pH = 7.4 条件下吸收最好。根据pH 分配假说，由于不同pH 状态下药物的解离程度不同，而马钱子碱、士的宁为生物碱，在碱性条件下，解离少，分子型药物多，吸收多，所以其吸收在弱碱性条件下效果最佳。本研究选取了5 个浓度进行外翻肠囊实验，结果表明在不同浓度条件下，马钱子碱和士的宁的表观渗透系数无显著性差异，说明药物吸收在肠道内无饱和现象，符合Ficks 扩散原理。可推测马钱子碱、士的宁的吸收机制可能以被动扩散为主。
本实验研究结果表明，维拉帕米和MK-571 能显著性增加马钱子碱及士的宁的吸收，抑制P-gp 和MRP 的外排作用，表明马钱子中马钱子碱、士的宁肠吸收机制可能同时存在主动转运，同时暗示着马钱子碱和士的宁可能是P-gp 和MRP 的底物。P-gp 和MRP 是肠上皮细胞中两种主要的外排转运蛋白，两者均可发挥外排泵作用，将细胞内的化合物逆浓度梯度转运至细胞外，这些外排泵系统是造成低生物利用度的原因之一，目前的研究认为，若某一药物的转运有P-gp 参与，则药物转运减慢。本研究通过考察加入P-gp 抑制剂和MRP 抑制剂前后马钱子碱和士的宁肠吸收的变化，证实了马钱子碱和士的宁的肠吸收机制具有P-gp 和MRP 的参与。
从本实验的结果而言，马钱子中马钱子碱、士的宁以被动扩散为主，但两者的吸收同时受P-gp 和MRP 的外排影响。作者认为马钱子碱、士的宁可能存在其他转运机制将P-gp 和MRP 外排作用抵消了，所以宏观上我们得到的结果为马钱子中马钱子碱和士的宁的转运机制是被动转运。通过EDTA 打开细胞间紧密连接虽然在一定程度上能促进马钱子碱、士的宁的吸收，但促进作用不明显。被动转运包括通过穿越细胞膜的脂质途径被动转运和通过细胞旁路被动转运。所以，我们推测马钱子碱、士的宁主要是以穿越细胞膜的脂质途径被动转运，有关机理还需进一步研究证明。
在新药开发及配伍对药研究的初期，常采用各肠道吸收模型来预测药物的吸收机制研究，进行新药及药对设计与剂型改进，以达到降低新药及配伍药对开发风险，大鼠外翻肠囊法是一种重复性好、操作简便的药物吸收模型，Wiseman 和Wilson首次采用离体外翻肠囊法研究肠道吸收功能，之后逐渐被广泛用于肠吸收特性研究。外翻肠囊模型应用于含药肠吸收实验，既可排除中药提取物中杂质对活性的影响，又可解决血清中生物活性物质的干扰问题，已在中药有效成分辨识、体外活性评价及机制研究等方面具有良好的应用。但是，药物吸收研究通常需采用两种及两种以上的实验方法来互相佐证。因此，本研究打算采用单向灌流法和Caco-2 模型对马钱子碱和士的宁的肠吸收机制进一步考察。
