在妇科恶性肿瘤中卵巢恶性肿瘤发病率居第三位，其病死率居女性生殖系统肿瘤的首位。由于其早期起病隐匿，缺乏明显临床症状，很难被及时发现和诊断，故约60%～70%的患者初诊时已是中晚期。目前，国内外对于中晚期卵巢癌的临床处理是行肿瘤细胞减灭术，术后辅以铂类联合紫杉类药物的化学治疗。但最终仍有超过70%的卵巢癌复发患者死亡。因此，目前对于卵巢癌的治疗迫切需要寻找一种副作用少且有效的新型药，以提高卵巢癌患者的生存率、生存质量等。漆黄素(3，3，4，7-四羟基黄酮)是黄酮类化合物的一种，属于多酚类化合物，是从黄栌等植物茎叶中提炼出来的食用性黄酮成分，广泛存在于各种水果蔬菜中如苹果、草莓、柿子、葡萄、洋葱和黄瓜等。目前，国内外研究发现漆黄素在各类癌症中表现出抗氧化、抗炎、抗细胞增殖、防肿瘤转移、抗血管生成、抗过敏、抗血小板等多种作用。本实验以不同浓度梯度的漆黄素作用卵巢癌细胞株，同时建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，观察肿瘤细胞的增殖、凋亡和移植瘤的生长情况，旨在探索漆黄素对卵巢癌生长抑制、促凋亡的可能机制，为漆黄素应用于卵巢癌的治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
漆黄素〔(纯度98%)，四川大学华西药学院〕;人卵巢癌细胞株SKOV3(四川大学华西第二医院妇科肿瘤生物治疗实验室);15只4～6周龄无胸腺雌性裸鼠(四川大学实验动物中心);DMEM 培养基、胎牛血清和胰酶(Gibico BRL 公司);噻唑兰(MTT，Sigma公司);流式细胞分析仪(BeckmanCoulter公司)。日立H-600IV型透射电镜(四川大学华西基础医学与法医学院);酶标仪(美国BIORAD公司，型号680);倒置生物显微镜(重庆光电仪器有限公司，型号XDS-1B);细胞培养箱〔日本SANYO公司，型号MCO-18M(UV)〕;标准超净化工作台(美国AIRTECH公司，型号SW-CJ-2FD)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养人卵巢癌细胞株SKOV3，细胞长满培养瓶底70%～80%后，用胰酶消化、收集、离心、传代。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 透射电镜(TEM)观察卵巢癌细胞内的超微结构
在生长状态良好的人卵巢癌细胞株SKOV3中加入漆黄素100mol/L作用细胞48h，然后将细胞用胰酶消化后收集于2mL离心管，2 000r/min离心15min，弃去上清液。用吸管沿离心管壁缓慢加入0.5%戊二醛固定液2mL，在4℃环境中静置10min。13 000r/min离心10min，弃去上清液。沿离心管壁缓慢加入3%戊二醛固定液2mL固定。最后经1%四氧化锇固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色。日立H-600Ⅳ型透射电镜将细胞放大8 000倍观察。
1.2.3 MTT法检测卵巢癌细胞的增殖情况
将生长状态良好的人卵巢癌细胞株SKOV3用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基将细胞配制成单细胞悬液，按每孔200L的体积接种于96孔板，细胞密度为每孔5103 个。每组设6个复孔，同时设立只加培养基的空白组。在37℃、体积分数5%CO2孵箱中培养，孵育24h贴壁后，更换培养基，并分别以漆黄素不同浓度梯度〔0(对照组)、25、50、100、200和400mol/L〕进行干预。混合孵育24～72h，待测孔内加入事先配制好的MTT溶液(5mg/mL)20L，在培养箱(37℃，体积分数5%CO2)中继续培养4h，终止培养后，小心吸取孔内培养上清液，每孔再加入二甲基亚砜(DMSO)150L，避光室温低速震荡10min，使结晶颗粒充分溶解。最后选择490nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，记录结果，并计算细胞抑制率，抑制率(%)=(1-加药组A 值/对照组A 组)100%。然后经改良寇式法计算50%生长抑制浓度(IC50)。
1.2.4 流式细胞术检测卵巢癌细胞的凋亡
当卵巢癌细胞铺满瓶底70%～80%时，予以25、50、100、200和400mol/L 漆黄素处理48h。用不含EDTA 的胰酶消化3 min，离心(2 000r/min，5min)收集。用含10%胎牛血清的PBS洗涤细胞2次(2 000r/min，离心5min)，收集5105 细胞，加入500L Binding Buffer悬浮细胞。然后加入5L AnnexinⅤ-FITC 混匀后，再加入5 LPropidium Iodide(PI)混匀。室温、避光、反应5～15min后，样本通过流式细胞仪计数1.5104 细胞进行分类分析。
1.2.5 漆黄素对卵巢癌移植瘤的抑制作用
1.2.5.1 试剂配制
将漆黄素溶解于聚乙二醇400(PEG400)∶DMSO=7∶3的混合溶剂中，配制质量浓度80mg/mL，使用Millipore 0.22m滤器过滤除菌，实验前1h制备好。
1.2.5.2 实验分组及处理
将生长状态良好的人卵巢癌SKOV3细胞消化、收集、离心，用PBS缓冲溶液重悬细胞后计数，调节细胞浓度为5107 mL-1，以0.1mL注射于无胸腺雌性裸鼠的双侧背部皮下。将15只无胸腺雌性裸鼠随机分为3组(n=5)：A组(对照组)，注射PEG400+DMSO;B组，注射PEG400+DMSO+漆黄素(200mg/kg);C组，注射PEG400+DMSO+漆黄素(400mg/kg)。于注射人卵巢癌细胞SKOV3一周后开始漆黄素干预，漆黄素给药方式为瘤体周围皮下注射，每周连续给药5d，休息2d，每次注射药物体积0.1mL，共持续2周。对照组注射相同体积的PEG400+DMSO混合液，给药方式相同。所有实验步骤均遵守中国科学院上海实验动物研究中心制定的实验动物指南。
1.2.5.3 移植瘤体积和质量的测量
裸鼠接种人卵巢癌SKOV3细胞后，从第1周周末开始，每周测量两次肿瘤组织体积。3周后用CO2处死裸鼠，解剖并取下瘤体组织，测量离体肿瘤组织的体积[13]和质量，拍照记录。取下的肿瘤组织消化并裂解细胞，用以检测蛋白表达改变。
1.2.5.4 Western blot检测
移植瘤中Bcl-2、Bax及聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)蛋白的表达 液氮条件下将移植瘤组织研磨成粉末，加入细胞裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，40 g/LCHAPS，65 mmol/L DTT，体积分数0.002Biolyte)并超声，室温下静置20min，然后在4℃下以13 000r/min离心1h，取上清液用蛋白定量分析试剂盒(Pierce BCA Protein Assay Kit)定量，余下样品-70℃保存。次日用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，PVDF膜转膜，经封闭、敷育抗体，洗膜，暗室显色等步骤。
1.3 统计学方法
百分率的比较用卡方检验;多组间的比较，先进行方差齐性检验，再进行单因素方差分析，组间两两比较采用Students t检验。P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 漆黄素对SKOV3细胞超微结构的影响
100mol/L漆黄素处理人卵巢癌SKOV3细胞株48h后，电镜下细胞超微结构。未处理的卵巢癌细胞具有较大的细胞核。经漆黄素处理后，在核膜下染色质形成界限清楚、均匀致密的团块;核仁的改变包括核仁周围散在的染色质凝结成异源性颗粒，位于核的中心;此时，胞浆的改变包括细胞骨架细丝的密集、核蛋白体颗粒成群，而在分泌细胞中，则有粗面内质网的再排列而形成同心圆状;在胞膜下可见较多光面内质网形成的透亮空泡，并可与浆膜融合。
2.2 细胞增殖抑制率结果
不同浓度梯度的漆黄素作用人卵巢癌细胞株SKOV3 24～72h，结果均显示漆黄素对SKOV3细胞的生长呈现抑制作用。随漆黄素浓度的增加，漆黄素对细胞的增殖抑制率增大，即漆黄素对细胞的抑制作用呈浓度依赖性。漆黄素IC50值为132mol/L。随漆黄素作用时间延长，同等浓度下细胞抑制率趋于稳定，3个时点间差异无统计学意义。
2.3 细胞凋亡结果
在流式细胞术双参数散点图中，左上象限为坏死细胞;左下象限显示活细胞，为AnnexinⅤ-/PI-;右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为AnnexinⅤ+/PI+;而右下象限为早期凋亡细胞，为AnnexinⅤ+/PI-。流式细胞术AnnexinⅤ/PI染色结果显示，与对照组相比，各漆黄素浓度组细胞总凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)均升高(P 均0.05)，且400mol/L浓度组mol/L浓度组mol/L浓度组(P0.05)。而漆黄素浓度25、50、100mol/L浓度组间的细胞凋亡率则无明显变化(P0.05)。
2.4 动物实验结果
2.4.1 裸鼠的基本情况
全部裸鼠在接种人卵巢癌细胞株SKOV3后，均在接种部位皮下出现约麦粒般大小的肿瘤;药物干预期间裸鼠未出现死亡。
2.4.2 移植瘤体积和质量的变化
结果显示，药物干预组随着时间的延长，肿瘤体积与对照组的差异增大，高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤体积抑制最为明显。裸鼠处死后，高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤的平均质量为(52524)mg，而低浓度(200mg/kg)漆黄素干预组肿瘤的平均质量为(87837)mg，均小于对照组〔(1 08642)mg，P0.05〕，并且高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组肿瘤质量低于低浓度(200mg/kg)漆黄素干预组(P0.05)。
2.4.3 移植瘤中Bcl-2、Bax等凋亡相关因子的表达
与对照组相比，经漆黄素治疗后的裸鼠移植瘤组织中Bcl-2的表达有所降低，而Bax蛋白的表达有所升高，PARP蛋白出现明显剪切，特别是高浓度(400 mg/kg)漆黄素干预组变化较明显。
3 讨论
手术辅以术后化疗可使卵巢癌的复发率下降28%，死亡率下降34%。尽管如此，卵巢癌的治疗结局依然不尽如人意，为提高卵巢癌尤其是中晚期卵巢癌患者的生存率及生存质量，寻找有效、安全、无毒或低毒性的新型药显得尤为重要。黄酮类化合物广泛存在于各种植物色素中，且被人类大量食用。目前，国内外研究发现漆黄素在各类癌症中均表现出抗癌作用，漆黄素对结肠癌细胞的研究发现，其可通过抑制环氧化酶-2(COX-2)和Wnt/表皮生长因子受体/核因子-B(Wnt/EGFR/NF-B)信号通路，诱导细胞凋亡和抑制癌细胞的生长。漆黄素对前列腺癌的研究发现漆黄素呈时间-剂量依赖性的抑制细胞生长并抑制DNA 合成，同时，漆黄素通过调节线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。在一项对宫颈癌的研究中显示漆黄素调控凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、细胞外信号调节激酶(ERK)和COX-2 的分子机制来诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡及抑制细胞生长。漆黄素对人肺癌细胞株A549的研究发现，漆黄素可降低肿瘤细胞存活率和克隆形成率，增加人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白酶同源的基因(PTEN)表达，抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达。漆黄素在胰腺癌中抑制死亡受体(DR3)介导的NF-B活化，降低基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达，抑制细胞生长，诱导凋亡。漆黄素是否具有抗卵巢癌作用，国内外文献报道均较少。本研究通过设计体内、体外两部分实验，应用现有成熟生物效应检测技术，观察漆黄素对卵巢癌细胞的作用，探究其作用机制，为寻找防治卵巢癌的有效低毒药物及临床探索提供有效的实验依据。
肿瘤的发生主要是由于细胞增殖的调节失控，恶性肿瘤的发生及发展还与肿瘤细胞凋亡失控密切相关。目前，细胞凋亡对肿瘤治疗作用的研究已成为肿瘤研究的热点之一。本研究首先通过电镜观察漆黄素作用后的人卵巢癌细胞株SKOV3，发现细胞结构发生了凋亡的变化，进而选择MTT实验，证实漆黄素明显抑制卵巢癌细胞的增殖，且增殖抑制作用呈浓度依赖性。这一结果与文献报道的漆黄素对其它肿瘤的抑制作用结果相一致。研究表明漆黄素能诱导各种肿瘤细胞凋亡，从而发挥对肿瘤的抑制作用，本研究通过流式细胞术也证实漆黄素能够诱导卵巢癌细胞的凋亡。本研究还建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型，探索漆黄素对裸鼠移植瘤的抑制作用。结果显示，漆黄素干预组移植瘤的体积和质量均低于对照组，且高浓度(400mg/kg)漆黄素干预组较低浓度(200mg/kg)组更明显。这与漆黄素对前列腺癌移植瘤的抑制作用一致。此外，另有研究表明漆黄素在对卵巢癌的治疗中是有效且安全的。
细胞凋亡是细胞的程序性死亡，它是由一类基因介导的细胞自主性死亡过程，表现为细胞膜完整，细胞体积变小，细胞核固缩，晚期可见凋亡小体。恢复和激发肿瘤细胞的凋亡能力并诱导细胞凋亡是肿瘤防治的有效方法。为进一步探讨漆黄素诱导裸鼠卵巢癌细胞的凋亡作用，本研究检测肿瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，结果显示，漆黄素干预组Bax蛋白表达高于对照组，Bcl-2表达明显低于对照组，且高浓度漆黄素干预组的表达水平变化更明显。作为保护因子的Bcl-2活性的降低和凋亡前蛋白Bax的激活使细胞更易损伤，从而促进细胞凋亡。而PARP被剪切则被认为是细胞凋亡的一个重要指标。动物实验进一步证实了漆黄素作为潜在抗瘤药物的有效性和可行性。这与近期的研究发现漆黄素对前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌等各种肿瘤均有抗细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用一致。
综上，本研究发现漆黄素在体内外均发挥了人对卵巢癌SKOV3细胞的抗肿瘤作用，抑制了卵巢癌的发生发展，因此，漆黄素有望成为一种预防和治疗卵巢癌的安全有效的天然药物。本课题组下一步拟扩大并细化检测漆黄素在诱导卵巢癌细胞凋亡信号通路中各蛋白表达水平改变，增加体内实验给药方式如血管内、腹腔内给药，探究药物体内作用机制及其安全性评估，为准备开展漆黄素临床药理学实验积累更多数据。
