近年来，功能性胃肠病(functional gastrointestinaldisorders， FGIDs) 的发病率正逐年上升， 但其发病机制仍不清楚， 大量研究显示内脏高敏感在FGIDs 发病机制中有着关键作用。随着辣椒素(capsaicin， Cap) 缓解疼痛的作用被逐渐认识，Cap 对FGIDs 内脏高敏感的研究越来越多。一些学者研究发现初次或短期使用Cap， 并不能立刻发挥镇痛作用， 相反， 还会引发或加重疼痛。随着使用时间的延长， Cap 才能逐渐展示其镇痛效果[1]。Cap通过刺激初级传入神经元末梢和细胞膜上的特殊受体而产生作用， 此受体称为辣椒素受体(TRPV1)。Cap 可通过激活消化道内TRPV1 的表达而影响内脏的高敏感性， 但Cap、TRPV1 和内脏高敏感的相互作用目前还不完全清楚。因此本研究通过喂食大鼠Cap 饲料， 研究连续摄入小剂量Cap 在不同时间点对不同性别大鼠内脏化学和机械刺激敏感性的影响。
材料与方法
实验动物清洁级SD 大鼠160 只， 雌雄各80 只，体重180 ~ 200 g， 饲养2 周以适应环境。药品与试剂Cap (99%浓度， 美国Sigma 公司);10FR 导尿管; 动物用新斯的明注射液; 兔抗大鼠TRPV1 多克隆抗体; 二步法免疫组化检测试剂(PV- 6001); DAB 显色试剂盒等。Cap 饲料的配制每日新鲜配制， 99% Cap 1 mg，加入到普通饲料粉100 g， 充分混匀成形， 即得到Cap 浓度为10 mgkg-1 的Cap 饲料。实验分组及分期SD 大鼠160 只， 随机分为对照组与观察组， 每组80 只， 雌雄各半。对照组摄入普通饲料; 观察组摄入Cap 饲料， 剂量为Cap1 mgkg-1d-1。每组再随机均分为5 小组， 分别观察给予Cap 后1 d、3 d、1 周、2 周和4 周的改变， 对应观察时间， 每小组大鼠16 只， 雌雄各半。内脏机械刺激敏感性测定采用直肠气囊扩张法。诱导大鼠排尽直肠内粪便， 石蜡油涂抹肛周，10FR 导尿管气囊端置入大鼠直肠， 胶布固定于尾部， 采用5 mL 空针向气囊内匀速注气， 边注气边观察腹痛相关行为即大鼠腹部撤离反射行为(abdominal withdrawal reflex， AWR)， 当大鼠行为达到AWR 评分的4 分， 结束注气， 记录气囊内注入的空气体积即气囊扩张的体积。AWR 行为评分标准： (1) 在给予刺激时， 大鼠情绪基本稳定，评为0 分; (2) 在给予刺激时大鼠变得不稳定，偶尔扭动头部， 评为1 分; (3) 大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部并未抬离地面， 评为2 分; (4)大鼠腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面， 评为3 分; (5) 大鼠腹部肌肉强烈收缩， 背部成弓形并把腹部、骨盆及会阴部抬离地面， 评为4 分。内脏化学刺激敏感性测定采用腹腔注射新斯的明方法。大鼠空腹状态， 用1 mL 注射器向腹腔内注射新斯的明注射液， 浓度为60 gmL-1， 剂量为120 gkg-1。注射完毕放入0.5 m2 干净饲养箱，立即计时， 观察大鼠行为变化， 记录到大鼠开始出现AWR 评分 3 分时的时间， 为化学刺激开始时间; 从化学刺激开始时间到大鼠行为首次恢复AWR 评分 3 分时间， 为化学刺激持续的时间。免疫组化法观察胃、十二指肠组织TRPV1 的表达取大鼠胃、十二指肠组织各一块， 固定包埋，采用二步法免疫组化染色检测TRPV1 的表达， 严格按照试剂盒说明行免疫组化染色。采用彩色病理图像分析软件分析， 计算阳性指数(PI)， PI =阳性信号面积平均吸光度值 测定面积， PI 值越大， 表示TRPV1 释放越多。统计学处理结果采用SPSS 19.0 统计软件分析，计量资料以x s 表示， 各组数据先进行独立性、正态分布及方差齐性检测， 多组样本均数之间比较当方差齐时采用双因素方差分析， 方差不齐时采用秩和检验。检验水准 = 0.05， P 0.05 为有显著意义。
结果
一般情况所有大鼠精神状态良好， 行动灵活，食欲佳， 皮毛光滑， 大小便正常。Cap 对大鼠内脏机械刺激敏感性的影响与对照组相比较， 喂食Cap 1 周， 观察组大鼠气囊扩张体积显著减少(P = 0.002)， 且雌性较雄性对气囊扩张实验更敏感(P = 0.001); 相反， 喂食Cap 4 周，观察组大鼠气囊扩张体积显著增加(P = 0.007);而喂食1 d、3 d、2 周观察组与对照组之间差异无显著意义(P 0.05)， 见表1。喂食Cap 饲料， 大鼠对内脏机械刺激敏感性的变化呈先增加后降低的趋势， 并以2 周时间为分界。
Cap 对大鼠内脏化学刺激敏感性的影响与对照组相比较， 喂食Cap 1 周， 观察组大鼠腹痛相关行为的持续时间显著延长(P = 0.001)， 而喂食Cap4 周， 观察组大鼠腹痛相关行为的开始时间显著延长(P = 0.02) ; 其余各组之间差异无显著意义(P 0.05)，。胃、十二指肠TRPV1 表达情况TRPV1 免疫阳性产物在大鼠胃、十二指肠组织均有表达， 呈棕黄色或黄色颗粒。与对照组比较， 给予Cap 1 d、3 d、1 周后， 观察组TRPV1 表达显著高于对照组(均P 2、4 周后， 观察组与对照组之间差异无显著意义(P 十二指肠组织TRPV1 的PI 值： 与对照组比较， 给予Cap 1 d、3 d 后， 观察组显著高于对照组(均P 1、2、4 周后， 观察组与对照组之间差异无显著意义(P 0.05)。
讨论
Cap 是从辣椒中提取的主要辛辣成分之一， 化学名为反8- 甲基- N- 香草基- 6- 壬烯基酰胺。研究发现辣椒中富含的Cap 除了能促进胃内黏液分泌，增加黏膜血供来保护胃黏膜， 还可能促进胃肠蠕动， 调节内脏高敏感， 甚至抑制消化道肿瘤发生。Cap 有刺激兴奋、感觉阻滞、长时程选择性神经毒性损害和不可逆性细胞破坏四种药理效应， 它的最终效应取决于给药的剂量和时间。初次或小剂量( 10 mgkg-1) 的Cap 作用于CAP 敏感传入神经(CSANs)， 可使该神经纤维产生一时性的兴奋，释放某些神经递质， 向上级神经元传递信号， 称为刺激兴奋; 当继续或反复使用Cap， 可使兴奋的CSANs 耗竭大量的神经递质而对刺激无反应， 出现脱敏 现象， 又称为Cap 的感觉阻滞作用;大剂量的Cap 在引起原初级刺激兴奋作用后， 可引起神经递质的过量释放， 导致CSANs 受到严重损害， 失去其信息传入功能， 此为Cap 选择性神经毒性损害， 甚至不可逆性细胞破坏， 亦称为Cap的化学去神经 作用。关于辣椒素的剂量，研究认为小剂量( 10 mgkg-1) 的Cap 可引起刺激兴奋; 大剂量( 50 mgkg-1) 的Cap 可使CSANs 产生化学 去神经 作用 ; 中等剂量(10 ~ 50 mgkg-1) Cap 可能会使兴奋的CSANs 产生感觉阻滞作用。本研究选用1 mgkg-1d-1 Cap，即小剂量Cap 进行实验。
Cap 既可致痛又可止痛， 初次应用Cap， 可产生烧灼样的疼痛感。CAO 等观察42 例健康志愿者服用Cap 胶囊后， 2 ~ 3 d 时间内有38 例出现了上腹疼痛， 其中部分志愿者15 min 即出现症状;但随着给药时间延长， 逐渐出现止痛的效果，BORTOLOTTI 等肠道功能性消化不良(FD) 患者连续3 周摄入0.35 mg 剂量的Cap 胶囊腹痛症状有所改善， FUHRER 等研究发现肠易激综合征(IBS) 患者连续服用Cap 胶囊4 周后， 其对不良化学刺激耐受性显著提高。大量研究证实FD 及IBS 患者具有内脏高敏感性， 表现为胃和直肠对机械或化学刺激疼痛阈值降低， TACK 等的研究显示约有34%的FD 患者存在内脏高敏感。如果应用Cap 缓解内脏高敏感， 需渡过其短期致痛效应， 延长Cap 的应用时间至关重要。也就是说， 若要开发Cap 作为镇痛药物治疗慢性腹痛症状， 疗程可能较普通药物更长。本实验将内脏刺激分为机械刺激和化学刺激， 结果显示， 摄入Cap 1 周大鼠机械和化学刺激敏感性显著增加， 2 周敏感性均下降， 和正常水平相当， 而到4 周时敏感性显著降低。另外， 在本实验中出现了机械刺激敏感性的性别差异， 摄食Cap 饲料1 周， 雌性大鼠敏感性显著高于雄性大鼠， 推测可能与雌激素抑制结肠平滑肌的收缩活动， 延缓胃肠转运有关。
TRPV1 被称为瞬时感受器电位通道， 广泛分布于脊髓背根神经节、三叉神经节、自主神经节的中、小神经元上， 以及胃肠道、食管黏膜、黏膜下层、平滑肌层以及血管周围。大量研究显示， 在FD 及IBS 患者中， 腹痛症状与TRPV1 的表达可能有一定的相关性。TRPV1 敲除降低了胃食管、空肠和结肠传入神经在扩张刺激下的机械敏感性。陈晓敏等对IBS 患者腹痛症状进行评估， 同时检测直肠、乙状结肠交界处组织TRPV1的表达情况， 结果发现IBS 患者结肠组织TRPV1表达显著高于对照组， 且与腹痛程度呈正相关。目前认为， Cap 通过激活TRPV1 在内脏高敏感中发挥重要作用。短期或初次应用Cap， 可通过激活TRPV1， 促进神经元内神经递质释放， 引起局部疼痛、烧灼样感觉， 连续刺激递质将被耗竭， 神经元不再敏感， 疼痛刺激将不再起效。本实验显示，喂食辣椒饲料1 d、3 d、1 周大鼠胃组织TRPV1表达显著升高， 2 周和4 周时下降至正常水平。大鼠内脏机械和化学刺激敏感性的改变， 可能与TRPV1 的表达水平相关。短期内摄入Cap 使TRPV1 的表达上调， 增加了内脏对机械及化学刺激的敏感性; 持续应用Cap， 机体逐渐适应， TRPV1的表达也随之下降， 因而敏感性也随之降低。综上所述， 连续摄入小剂量Cap 1 周， 大鼠对内脏机械或化学刺激的敏感性显著增加， 其中雌性对内脏机械刺激较雄性更为敏感， 连续2 周敏感性逐渐恢复至正常， 连续4 周敏感性显著降低，且大鼠胃、十二指肠黏膜屏障均无明显影响。四川是辣椒的产地之一， 辣椒素原料丰富原料价格便宜， Cap 能否作为治疗内脏高敏感患者的新药及其口服剂量和治疗疗程， 有待进一步研究。
