腰痛宁胶囊以马钱子粉(调制)为君，以土鳖虫、川牛膝、甘草、麻黄、乳香(醋制)、没药(醋制)、全蝎、僵蚕(麸炒)、麸炒苍术为辅，按一定比例配伍而成，伴以黄酒吞服。具有消肿止痛、疏散寒邪、温经通络之功效，用于寒湿瘀阻经络所致的腰椎间盘突出症、坐骨神经痛等疾病，现收载于《中国药典》2015年版一部。君药马钱子为有毒中药，士的宁既是其主要有效成分又是有毒成分，占马钱子总生物碱的50%左右，故本课题以士的宁作为研究成分;黄酒被用于药用，历史悠久，多用于炮制，有研究显示，从机体细胞层面考察，黄酒配腰痛宁全方可增大各组分间的协同作用。目前科学工作者们对腰痛宁胶囊的有效成分检测、作用机制、药理毒理、临床观察等方面已做了大量研究，但鲜见关于腰痛宁胶囊药代动力学的研究报道，已报道的腰痛宁胶囊药动学研究中，均是以混悬液灌胃，而非胶囊剂型给药，结果可能出现偏差，不能真实反映腰痛宁胶囊的药动学行为;且腰痛宁胶囊作为国家中药保护品种，验证其配方的合理性，既是对患者负责，也为指导临床安全合理用药提供参考。本课题比较了马钱子粉(调制)胶囊组、腰痛宁胶囊组以及腰痛宁胶囊配黄酒组中士的宁在家兔体内的药动学行为，为腰痛宁胶囊全方配伍合理性提供了依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验仪器
Agilent Technologies 1260Infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，AL 104型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，AE 240型电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，MX-S可调式混匀仪(北京大龙兴创实验仪器有限公司)，KQ-700DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，TDL-40B型离心机(上海安亭科学仪器厂)，TG16-WS台式高速离心机(长沙湘仪离心机有限公司)，TDA-8002型水浴锅(余姚明伟仪表厂)。
1.1.2 药品与试剂
士的宁对照品(中国食品药品检定研究院，供含量测定用，按97.1% 计，批号：110705-201307)，肝素钠注射液(常州千红生化制药股份有限公司)，庚烷磺酸钠、磷酸(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，磷酸二氢钾(分析纯，天津市标准科技有限公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)，氢氧化钠(分析纯，天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司)，二氯甲烷(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，试验用水(超纯，由Milli-Q制备)，马钱子粉(调制)胶囊(课题组自制)，马钱子粉(调制)(由颈复康药业集团有限公司提供)，腰痛宁胶囊、黄酒(由颈复康药业集团有限公司提供，批号：491203)。
1.1.3 实验动物
新西兰兔，体重(2.50.5)kg，雌雄兼备，由北京隆安实验动物养殖中心提供，许可证号：SCXK(京)2014-0003。
1.2 马钱子粉(调制)胶囊制备
取马钱子粉(调制)装1号胶囊，备用。
1.3 动物给药方案及样本采集
新西兰兔禁食不禁水12h后，随机分为3组，每组5只。根据文献及预实验结果，结合士的宁在马钱子粉和腰痛宁胶囊中的质量分数计算，折合给药剂量：马钱子粉(调制)胶囊组(以下简称马钱子粉组)为166.4mg/kg;腰痛宁胶囊组为416mg/kg;腰痛宁胶囊配黄酒组为腰痛宁胶囊416mg/kg，黄酒3.45mL/kg。按上述剂量以胶囊形式灌胃给药，腰痛宁胶囊配黄酒组用灌胃器送服黄酒。每只新西兰兔分别于给药前及给药后0.25、0.50、0.75、1.0、1.50、2.0、2.50、3.0、3.50、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0h耳缘静脉取血3mL置肝素化离心管中，3 000r/min离心10min，分离血浆，-20℃冷冻保存。
1.4 血浆中士的宁浓度检测
1.4.1 色谱条件
Agilent 5TC-C18色谱柱(250mm4.6mm，5m)，Agilent TC-C18预柱;以乙腈为流动相A，0.01mol/L庚烷磺酸钠与0.02mol/L磷酸二氢钾等量混合(用10%磷酸调pH=3.0，临用前配制)为流动相B，甲醇为流动相C，梯度洗脱条件：0～22min，A从20%20%，B从79.5%79.5%，C从0.5%22～30min，A从20%40%，B从79.5%60%，C从0.5%30～35min，A从40%20%，B从60%79.5%，C从0%35～40min，A 从20%20%，B 从79.5%79.5%，C 从0.5%0.5%。VWD检测器，检测波长为254nm;流速为1.0mL/min;柱温为25℃;进样量为70L。
1.4.2 血浆样品处理方法
取待测血浆样品，37℃水浴解冻，精密吸取1.5mL置50mL离心管中，加乙腈和2mol/L NaOH溶液各0.5mL，涡旋30s，置冷水中超声15min，加二氯甲烷5mL，涡旋1min，3 000r/min离心10min，收集下层液;残液再加二氯甲烷4mL重复提取;合并两次下层液于37℃ 水浴氮气吹干，100L 流动相复溶，涡旋1min，12000r/min离心15min，取上清液，即得供试品溶液。
1.4.3 标准溶液配制
标准储备液配制：取士的宁对照品适量精密称定，置10mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成浓度为0.8351mg/mL的士的宁储备液，-20℃冷藏备用。标准溶液配制：精密吸取士的宁储备液适量，用流动相稀释并定容，得到质量浓度为0.04、0.22、0.38、0.75、1.50、4.45、7.52、15.03g/mL士的宁系列标准溶液，4℃冷藏备用。标准样品、质控样品制备：分别吸取新西兰兔空白血浆1.5mL，分别加入士的宁系列标准溶液20L，涡旋30s，配成质量浓度为0.60、3.01、5.01、10.02、20.04、55.67、100.21、200.41g/L的系列标准含药血浆样品，按1.4.2项下操作，制成不同浓度的标准供试品溶液。同法操作，制备定量下限(0.60g/L)、低(1.80g/L)、中(55.67g/L)、高(150g/L、200.40g/L)不同质量浓度水平的质控样品供试品溶液。
2 实验结果
2.1 选择性
依照本实验条件，士的宁峰与其他峰分离良好，峰形对称，血浆中内源性物质无明显干扰。
2.2 残留
通过先后注射高浓度质控样品、空白样品后，在空白样品色谱图士的宁峰相应位置无残留。
2.3 标准曲线与定量下限
按照1.4.3项下制备3批不同浓度的标准供试品溶液，按照1.4.1项下色谱条件自动进样分析。以士的宁血药浓度C(g/L)为X，峰面积为Y，用加权(1/C2)最小二乘法进行线性回归运算，结果表明，士的宁血药浓度在0.60～200.41g/L范围内线性关系良好，三批线性回归方程分别为：Y=1.340X+1.479，r=0.9980;Y=1.487X+1.710，r=0.9985;Y=1.454X+1.323，r=0.9980。定量下限为0.60g/L。
2.4 准确度与精密度
按照1.4.3项下方法于制备定量下限(0.60g/L)、低(1.80g/L)、中(55.67g/L)、高(150g/L)4个不同质量浓度水平的质控样品供试品溶液，平行样5份，测定;连续测定5天，每天每个浓度制备1个样品，每个样品测定1次。记录士的宁峰面积，根据随行标准曲线线性回归方程计算质控样品浓度，求得批内、批间准确度与精密度，准确度表示为：(测得值/真实值)100%，精密度表示为RSD值，结果均符合生物样品定量分析方法验证要求。
2.5 稳定性
标准储备液稳定性：考察士的宁标准储备液在室温放置0、4、8、12h稳定性以及士的宁标准储备液在-20℃储存0、1、3、5、10、15、30d的稳定性，按照1.4.3项下方法稀释成15.03g/mL，进样10L测定峰面积，RSD值分别为室温：1.81%;-20℃：1.64%，均小于2%，符合生物样品定量分析方法验证要求，表明士的宁标准储备液在室温储存12h、-20℃储存30d稳定性良好。
标准溶液稳定性：考察士的宁标准溶液(0.22、4.45、15.03g/mL)在4℃储存0、1、3、5、10、15、30d稳定性，分别进样10L 测定峰面积，RSD 值分别为1.96%、1.34%、0.25%，均小于2%，符合生物样品定量分析方法验证要求，表明士的宁标准溶液(0.22、4.45、15.03g/mL)在4℃储存30d稳定性良好。质控样品稳定性：按照1.4.3项下方法制备低(1.8g/L)和高(200.4g/L)浓度质控样品，考察质控样品在室温放置0、4、8、12、24h的稳定性;-20℃到室温冻融循环0～3次稳定性;-20℃保存0、5、10、15、20d稳定性以及质控样品按照1.4.2项下操作所得供试品溶液在室温放置0、4、8、12、24h的稳定性。结果-20℃保存10d内稳定，0～10d测得每一浓度的均值与标示浓度的偏差分别为5.99%、0.14%;质控样品室温存储偏差：9.93%、3.01%;-20℃冻融循环偏差：10.79%、4.36%;质控供试品溶液室温静置偏差：8.93%、0.41%。每一浓度的均值与标示浓度的偏差均在15%以内，符合生物样品定量分析方法验证要求，表明质控样品(1.8、200.4g/L)分别在室温放置24h、-20℃冻融循环3次、-20℃保存10d稳定性良好，质控供试品溶液室温静置24h稳定性良好。
2.6 药物代谢动力学行为
按照1.3项下方法进行动物分组及处理，按照1.4.2项下方法操作测得马钱子粉组、腰痛宁胶囊组、腰痛宁胶囊配黄酒组血浆样品中士的宁的浓度，以血样采集时间T(h)为横坐标，平均血药浓度C(g/L)为纵坐标，绘制士的宁血药浓度-时间曲线。
2.7软件包
进行房室模型拟合，利用统计矩法计算药物动力学参数(非房室模型)，并对主要参数进行t检验，结果见表2。结果表明，家兔灌胃马钱子粉(调制)胶囊、腰痛宁胶囊、腰痛宁胶囊配黄酒后，以1/C2 为权重系数，三组士的宁代谢过程均符合三室开放模型。t检验结果表明，腰痛宁胶囊组与马钱子粉(调制)胶囊组的AUC(0-t)、AUC(0-)、CL、V、Cmax有显著性差异，腰痛宁胶囊配黄酒组与马钱子粉(调制)胶囊组的CL、V、Cmax有显著性差异;腰痛宁胶囊配黄酒组与腰痛宁胶囊组药动学参数虽无显著性差异，但AUC(0-t)、AUC(0-)、Cmax均大于后者。
3 讨论
前期研究中已对含士的宁血样处理方法、色谱条件进行了探索，后根据2015版《中国药典》中生物样品定量分析方法验证指导原则进行了调整并验证，方法准确，重复性高，所测项目均符合指导原则验证要求。
虽然腰痛宁胶囊配黄酒组与腰痛宁胶囊组在各参数上无显著性差异，并不能代表配黄酒后对治疗无影响，因为腰痛宁胶囊有效剂量与中毒剂量接近，轻微的变化就可能影响药效和安全。家兔灌胃马钱子粉(调制)胶囊、腰痛宁胶囊、腰痛宁胶囊配黄酒后，3组士的宁的达峰时间依次延迟，说明配伍后药效的发挥更为缓和。士的宁在马钱子粉(调制)胶囊组生物利用度最高，腰痛宁胶囊配黄酒组次之，腰痛宁胶囊组生物利用度最低，而腰痛宁胶囊组清除速率最快，腰痛宁胶囊配黄酒组次之，马钱子粉(调制)胶囊组最慢。说明腰痛宁胶囊组方可显著加快士的宁在体内的清除，从而降低士的宁在体内的生物利用度;配黄酒后又可适当降低清除率，提高生物利用度。另外马钱子粉(调制)胶囊组士的宁Cmax最高，腰痛宁胶囊配黄酒组为其2/3，腰痛宁胶囊组仅为其1/2，表明腰痛宁胶囊可降低士的宁达峰浓度，保证用药安全，但由于士的宁有效剂量与中毒剂量接近，抑制太过，反而阻碍药效的发挥;黄酒可适当提高士的宁达峰浓度，这可能是黄酒促进了士的宁在体内溶出的缘故，在安全的基础上保证了药效，表明腰痛宁全方配伍合理。若能对家兔最低有效血药浓度和最低中毒血药浓度进行测定，找到治疗窗的体内浓度，将更有说服力，但这需要合适的动物模型，需要科研工作者的继续探索才能实现。
