肝脏是机体重要的代谢器官，是化学毒物或药物在体内代谢或转化的重要场所，因此肝脏极易受到外源性物质的攻击，从而引发急性或慢性损伤。目前，肝病已成为我国最突出的公共卫生问题之一，是与艾滋病、肺结核和血吸虫病并列危害最严重的四大传染疾病之一。因而，研究抗肝脏疾病的有效功能性食品成分或药物显得犹为重要。
小球藻(Chlorella vulgaris)是一类普生性球形单细胞绿藻，生态分布极广，在淡水、海水中均有发现。小球藻含有丰富的蛋白质、多糖、脂质、叶绿素、维生素、微量元素、核酸和一些生物活性代谢产物，有药物藻类之美誉。研究表明，小球藻具有激活淋巴细胞、增强免疫力、抵抗外来疾病的入侵、促进人体受伤组织修复等功效，降血压、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、解毒等功效。四氯化碳(CC14)是一种常见的肝毒性化合物，可诱导急性肝损伤、肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝脏疾病的发生，常用于实验室急性肝损伤的造模。本实验通过CC14 致小鼠肝损伤模型，探讨小球藻水提物对小鼠急性肝损伤的保护作用与机制，以期为小球藻功能性食品的开发及应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
四氯化碳(CCl4)，Sigma;玉米油;丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒，Biochem;天冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒，Biochem;Bio-Plex Multiplex 细胞因子试剂盒，Bio-Rad。
1.2 实验动物
健康雄性ICR 小鼠60 只，体重(20~25 g)。小球藻由韩国Marine Microalgae Culture Center 提供。
1.3 小球藻水提物的制备
将 500 g 干燥的小球藻粉混悬于适量蒸馏水中，90 ℃，30 min，提取两次，合并提取液，离心60 min，上清液用1 m 玻璃纤维滤器过滤后，冷冻干燥，得粗粉63 g，于-20 ℃保存备用。
1.4 动物分组及给药方法
健康雄性ICR 小鼠60 只，随机分为正常组，模型组，小球藻水提物大剂量组、中剂量组、小剂量组和水飞蓟素阳性对照组6 个组，每组10 只，隔天灌胃给药。小球藻水提物给药组分别按50，100，200 mg/kg 小球藻水提物灌胃，阳性对照组按100 mg/kg水飞蓟素灌胃，正常组、模型组按等体积生理盐水灌胃，共30 d。末次给药1 h 后，模型组和给药组腹腔注射20 mg/kg CCl4 玉米油溶液(2 mL/kg)，正常组腹腔注射等体积玉米油溶液，禁食，不禁水。24 h 后乌拉坦麻醉，下腔静脉取血，离心后取得血清，置于-20 ℃保存。采血后迅速摘除肝脏，用冷PBS 缓冲液洗涤干净，滤纸吸干水分后，-80 ℃保存。
1.5 血清学指标检测
应用全自动生化分析仪测定小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及草氨酸氨基转移酶(AST)的水平。
1.6 病理学指标检测
于肝左叶取材，10 %福尔马林固定，石蜡包埋，5 m 连续切片，HE 染色，光镜下观察观察各组小鼠肝脏组织学变化，肝细胞变性坏死，炎性浸润等，并拍照。
1.7 小球藻水提物对炎性细胞因子分泌影响
取肝脏匀浆上清，按照Bio-Rad 公司试剂盒说明书，使用Luminex 100 analyzer (Luminex Corp., Austin, TX)进行炎性细胞因子TNF- 含量测定，利用MasterPlex QT Analysis version 2(MiraiBio, Alameda, CA)制作标准曲线进行定量。1.8 统计学处理本文中的各项实验每组均重复3 次以上，数据用MeanSD表示，结果比较采用单因素方差分析和ANOVA 检验统计分析。p0.05 为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 小球藻水提物对CCl4 所致肝损伤小鼠血清ALT 及AST 活性的影响
与正常对照组比较，肝损伤模型组小鼠血清ALT 及AST 水平明显升高，说明造模成功。给予小球藻提取物预保护的实验组小鼠血清ALT 及AST 水平均显著低于模型组，且随给予小球藻水提物的剂量增加，ALT 及AST 降低水平呈剂量依赖趋势。
2.2 病理学检测结果HE
病理切片在显微镜下观察，正常对照组肝小叶结构完整清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列，排列整齐，无坏死及脂肪变性(A);CCl4 模型组肝组织明显损伤，肝细胞浊肿、气球样变性，大部分正常肝小叶结构破坏或消失，肝细胞脂肪变性及坏死严重(B)。阳性药水飞蓟素组肝细胞浊肿减轻，坏死灶减少，汇管区炎细胞浸润减轻(C)。与模型组比较，给药低、中、高剂量组肝组织损伤均有不同程度的减轻，灶状坏死灶减少，较少肝细胞脂肪变性，浊肿、气球样变及间质炎症减轻(D-F)，其中高剂量组较低、中剂量组效果好.
2.3 小球藻水提物对CCl4 所致肝损伤小鼠肝脏细胞因子分泌的影响
对各组肝匀浆进行炎性细胞因子TNF- 检测，结果显示如图，CCl4 能够有效刺激肝细胞分泌炎性细胞因子TNF-，与正常对照组相比有显著性差异(p0.01)。小球藻水提物干预时，TNF- 产生的量显著降低，显示了小球藻水提物对CCl4 诱导的炎性细胞因子分泌的抑制作用，且呈剂量依赖性增加(p0.05)。
3讨论
肝脏是机体重要的代谢器官，在糖类、脂类及蛋白质代谢过程中起着重要作用。CCl4 是一种典型的化学性肝损伤诱导剂，本实验采用腹腔注射CCl4 建立小鼠急性肝损伤模型，研究小球藻水提物对肝损伤的保护作用及可能的机制。ALT 和AST 是肝脏代谢的主要酶类，当肝细胞有炎症或受到损伤时，肝细胞膜通透性增加，线粒体受损，血液中ALT 及AST 升高，因此，检测血清ALT和AST 水平是检验肝细胞操作程度的灵敏而特异性指标。本研究结果显示，小球藻水提物可明显抑制CCl4 引起的小鼠血清ALT及AST 水平上升，并呈剂量依赖趋势。同时，通过肝组织病理学观察，小球藻水提物干预后，小鼠肝细胞无大量坏死，炎性浸润减少，肝细胞脂肪变性降低，表明小球藻水提物对肝脏损伤具有保护作用。炎性反应对机体的影响是一把双刃剑。在炎性反应发生初期，当巨噬细胞受到相应刺激后便会被激活，这些活化的巨噬细胞可分泌TNF-。TNF- 是一种多功能的促炎性细胞因子，能够刺激一系列促炎物质，如IL-1 等的产生[6-7]，TNF- 在诱导肝脏炎症和引起肝脏损伤过程中发挥重要作用[8]，因此，降低促炎性细胞因子TNF- 能够缓解CCl4 造成的肝脏炎症。本实验结果显示，小球藻水提物降低了TNF- 的含量，该结果显示小球藻水提物具有降低肝脏炎症的作用，从而实现对肝损伤的保护作用。
4 结论
本实验研究结果表明，小球藻水提物对CCl4 造成的急性肝脏损伤具有一定的保护作用，能够降低炎性细胞因子的分泌，提示小球藻水提物可能对相关炎症疾病具有保护作用。这些研究为小球藻水提物用于防治炎症提供一定的依据，但是其在分子水平的作用机理还有待进一步研究。
