本项研究所用四逆汤为《伤寒论》之经方，百合固金汤典出明代《慎斋遗书》。此两方之立方均据张仲景之六经辩证。且推其早年之回阳救逆和滋阴养肺功效均与感染性疾病有不解之缘。此两方之药理又恰为中医养阴回阳治则之代表。故选此两方为对照，观察机体感染发生过程中，两者对固有免疫调节之异同，极有可能揭示养阴回阳两种治则对免疫细胞之实际作用。在基于经验的中医临床治则和基于实证的现代免疫药理之间牵起一线姻缘。
Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是表达于巨噬细胞表面的一类模式识别受体(pattern recognition receptor， PRR)，在固有免疫应答中发挥了重要的作用。研究发现TLR2与TLR4在炎症信号转导途径中并非起协同作用，研究发现TLR2的表达能抑制TLR4信号的过度激活。故推测TLR2和TLR4可能是养阴回阳两种治则对免疫细胞，尤其对固有免疫细胞的功能产生调节的重要物质基础和药理作用靶标。TLR2和TLR4是识别结核分枝杆菌的主要模式识别受体，此文选取临床治疗结核感染的百合固金汤和对感染性休克起治疗作用的四逆汤为例，观察两方对RAW264.7细胞表面TLR2和TLR4比值是否存在影响，作为深入探讨养阴回阳治则在抗感染作用研究中的引玉之砖。
1 材料与方法
1.1 动物、细胞及细菌
体重(2.00.2)kg，健康雄性新西兰大白兔10只，由上海中医药大学动物实验中心提供。小鼠巨噬细胞RAW264.7，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。结核分枝杆菌株H37Ra，引自上海复旦大学遗传学研究所。
1.2 主要试剂
百合固金汤和四逆汤个饮片，均购自上海养和堂中药饮片有限公司;庆大霉素注射液，购自上海中医药大学附属曙光医院;DMEM高糖培养液、胎牛血清、胰酶，均购自Gibco公司;7H9、7H10培养基，均购自BD Difco公司;TRIzol试剂， 购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒及2PCR Mixture， 购自TAKARA 公司;PCR 引物，由上海生工生物工程有限公司合成;FITC标记anti-mouse CD282(TLR2)荧光抗体与PE标记anti-mouse CD284(TLR4)荧光抗体及其同型对照，均购自于Biolegend公司;PCR-Fluorescent Probing试剂盒，购自凯杰生物工程(深圳)有限公司。
1.3 细菌培养
用含10%ADC的7H9培养液，在37℃恒温培养箱中培养，每周观察1次，一般培养1～2周可见瓶底有细菌颗粒生长，(10～15)d达对数生长期。取对数生长期细菌用不含血清的DMEM 培养液重悬，调整细胞密度为1107 个/ml。
1.4 细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW264.7按常规方法用含有10%胎牛血清的DMEM 高糖培养液，在37℃，5% CO2培养箱中培养，调整细胞密度为1106 个/ml，以每孔2ml铺于6孔板中，24h后用于后续实验。
1.5 含药血清的制备及细胞干预
各方按临床用药量乘以动物的体表面积系数求得相应给药量，经常规方法煎煮，浓缩至10倍剂量置4℃冰箱备用。10只新西兰大白兔随机分为空白对照组(control，4只)、百合固金汤组(BGD，3只)和四逆汤组(SND，3只)。各用药组按10ml/kg灌服相应药液，对照组灌服等量生理盐水。每日1次，连续4d。于最后一次灌胃1h后心脏采血(最后一次给药前禁食不禁水12h)分离血清，同组动物血清混匀，56℃灭活30min后，经0.22m 微孔滤膜过滤除菌，分装置-80℃冰箱备用。将RAW264.7细胞密度调整为1106 个/ml，每组设3复孔，2ml/孔铺于6孔板常规培养24h后，各用药组加入含10%相应含药血清的DMEM 培养液继续培养，对照组加入含10%空白兔血清培养液进行培养，24h后检测各组TLR2、TLR4的mRNA 及蛋白表达量。
1.6 感染模型建立及药物干预
模型组用含10%空白兔血清的培养液重悬沉淀细胞，分别作用24h和48h后进行相关指标的检测。各含药血清组及对照组按照细胞∶细菌为1∶10的比例加入用10%相应含药血清培养液重悬的细菌，密度为1107 个/ml的Mtb H37Ra，2ml/孔。
1.7 指标测定
TLR2与TLR4的mRNA表达以RT-QPCR 的方法检测， 以GAPDH 作为内参，结果用2-△△Ct表示。TLR2与TLR4蛋白表达水平的检测，以FACS检测细胞表面TLR2与TLR4的表达百分比。细胞吞噬、杀菌能力测定，以QPCR检测巨噬细胞内结核分枝杆菌DNA含量： 按照凯杰生物工程(深圳)有限公司的PCRFluorescent Probing试剂盒说明做标准曲线后计算各样本中的结核分枝杆菌拷贝数。
1.8 统计学分析
所有数据以xs表示，应用SPSS18.0软件进行统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析，二组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 百合固金汤和四逆汤
含药血清对TLR2与TLR4 mRNA表达的影响及其比值的改变 表1结果显示，与对照组相比，百合组RAW264.7细胞TLR2mRNA的表达没有明显差异(P0.05)，但TLR4mRNA 水平较之上升明显(P 0.05)，TLR2/TLR4 下调明显(P 四逆组RAW264.7细胞TLR2及TLR4mRNA的表达都明显上升(P0.05)，但TLR2/TLR4较之无明显差异。两用药组之间比较TLR2、TLR4及TLR2/TLR4的差异均有统计学意义(P0.05)。
2.2 百合固金汤和四逆汤
含药血清对TLR2与TLR4蛋白表达的影响及其比值的改变 图1、表2结果表明，与对照组相比，两用药组RAW264.7细胞表面TLR2和TLR4表达百分率均有上升，TLR2增加尤为明显(P0.05)，两用药组之间相比可见百合组TLR2 百分数较四逆组低(P 0.05)，但TLR4百分数较四逆组高(P0.05)。表中结果显示，与对照组相比，百合组TLR2/TLR4比值比空白组略低，但不明显(P0.05)，而四逆组TLR2/TLR4比值明显高于空白组(P0.05)，两用药组相比，四逆组TLR2/TLR4比值较百合组增长更明显(P0.05)。
2.3 百合固金汤和四逆汤含
药血清对巨噬细胞吞噬杀菌能力的影响 QPCR法检测巨噬细胞内结核杆菌DNA的表达水平，以细菌数量取lg10作统计处理，图2显示Mtb H37Ra与RAW264.7细胞作用24h和48hQPCR法检测到的细菌含量差异，24h结果显示三组之间无明显差异，而48h的结果显示百合组的细菌含量较其他两组明显减少(P0.05)。各用药组24h和48h的前后比较发现百合组较之对照组和四逆组其杀菌能力明显提高(P0.05)，提示百合固金汤抗痨作用可能与调节TLR2/TLR4比值相关。
3 讨论
TLR是一种重要的PRR，能够识别多种病原相关分子模式(PAMP)，TLR的研究已涉及到肿瘤，自身免疫性疾病，自身代谢性疾病及各种感染性疾病等多个领域。在目前发现的10种人类TLR中，TLR2与TLR4是其中研究得较为清楚的两种。TLR2可广泛识别多种病原相关分子模式，包括革兰阳性菌的磷壁酸和肽聚糖、分枝杆菌胞壁组分、细菌脂蛋白、钩端螺旋体的LPS、酵母菌细胞壁等等，TLR4是第一个在哺乳动物发现的TLR，可以识别LPS、磷壁酸、热休克蛋白、呼吸道合胞病毒F蛋白等配体。以往许多研究显示TLR2、TLR4能够启动机体的固有免疫应答，对病原体发挥杀灭清除作用。通常认为TLR2、TLR4都可经MyD88(myeloid differentiation factor 88)途径调控炎症基因的转录。但也不排除两者都存在有非MyD88依赖的转导途径。尽管多数文献认为TLR2与TLR4在炎症信号转导途径中起协同作用，但Finamore等对乳酸杆菌的研究时发现，TLR2在抑制TLR4信号过度激活的过程中有重要作用，可能成为抗炎治疗的新的靶点。而早在2012年，国内就有过类似的报道，北京解放军第306医院消化内科曹艳菊用双歧三联活菌治疗急性结肠炎模型大鼠，随后检测TLR2、TLR4及NF-B的表达，结果发现益生菌组TLR2表达较模型组明显增加，而TLR4表达明显下降，NF-B活性较模型组也明显降低，提示益生菌可能通过进一步增加TLR2 的表达，并抑制TLR4的表达，进而调控NF-B的活性，以缓解肠道炎症。这些发现与本实验所提供的研究结果似有类似之处，提示某些药物或微生物确实可以诱导形成TLR2、TLR4表达的拮抗局面，并由此而影响感染与炎症的发展与转归。
在本项研究的结果中，似乎可提示以四逆汤(附子、干姜、甘草)为代表的回阳救逆治则与以百合固金汤(百合、玄参、白芍、生地、熟地等)为代表的养阴治则在对感染过程中识别病原体的PRR表达类型可产生不同的调节格局，如本项研究所显示。或许百合固金汤对TLR4表达增高的调节作用与其治疗结核病的临床功效有着内在联系(启动炎症通路，清除细胞内的结核分枝杆菌);而四逆汤之增高TLR2表达的作用也是和其治疗感染性休克的临床作用不可分离(有可能通过TLR2/TLR4的拮抗作用，降低了TLR4对LPS的反应敏感性)。尽管这样的推论与猜测还需要更多深入的研究去加以验证，但目前的发现无疑是一个新的开端。这为中医阴阳理论在感染性疾病的实践应用中所取得的卓越疗效提供了可能的科学解释。
