[摘要] 目的 探讨RECK、MMP-14及VEGF在喉癌中的表达情况及临床意义。 方法 选择2013年8月～2015年1月辽宁省肿瘤医院选手术治疗的喉癌患者41例，分别取其喉癌组织和癌旁组织，另取喉息肉行手术切除患者的息肉组织作为对照。分别采用Realtime-PCR和Western blot检测各组织中RECK、MMP-14及VEGF mRNA和蛋白的表达情况，分析其与喉癌临床病理特征的相关性。 结果 MMP-14和VEGF在喉癌组织的表达明显高于癌旁组织及息肉组织（P < 0.05），且其表达与病理分级、淋巴转移及临床分期有关（P < 0.05）；RECK喉癌组织的表达低于癌旁和息肉组织，其与MMP-14（r = -0.812，P = 0.027）和VEGF（r = -0.907，P = 0.013）呈负相关。 结论 联合检测RECK、MMP14和VEGF基因对喉癌患者的诊断、转移及临床分期的确定具有重要意义。
[关键词] 喉癌；基质金属蛋白酶-9；基质金属蛋白酶-14；转移
[中图分类号] R736.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）01（b）-0085-04
[Abstract] Objective To investigate expression and clinical significance of RECK， MMP-14 and VEGF in laryngeal carcinoma. Methods From August 2013 to January 2015， in Tumor Hospital of Liaoning Province， 41 patients with laryngeal cancer and underwent surgical treatment were sel
[Key words] Laryngeal； Vascular endothelial growth factor； Matrix metalloproteinase 14； metastasis
喉癌源于喉上皮，是头颈部发病率第二高的恶性肿瘤，具有高度的侵入性和转移性，其发生发展涉及多种因素和多个步骤[1-2]。基质金属蛋白酶14（matrix metalloproteinase 14，MMP-14）是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族的重要成员之一[3]，参与家族中其他MMPs的激活，起到降解和重塑细胞外基质的作用，同时在胃癌、乳腺癌和食管癌等众多癌症的侵袭转移中发挥重要作用[4-5]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生，在肿瘤转移及肿瘤再生中发挥重要作用[6]。RECK（reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs，RECK）基因是一种新型肿瘤转移抑制基因和MMPs抑制剂，已报道RECK对MMP-14和MMP-2等多种MMPs家族成员有抑制作用，该作用可以抑制肿瘤细胞的生长、发展及侵袭[7-8]。本研究通过采用Realtime-PCR和Western blot检测喉癌患者组织中RECK，MMP-14和VEGF mRNA和蛋白的表达情况，进一步分析其与喉癌临床病理特征的相关性，为喉癌的转移和预后的判断提供一定的实验依据，为其机制研究奠定基础。 1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2013年8月～2015年1月于辽宁省肿瘤医院手术治疗的喉癌患者41例，其中男29例，女12例，年龄45～81岁，患者术前均无放疗、化疗及其他免疫治疗经历，签署知情同意书，在术中分别取喉癌组织和癌旁组织；此外，在此期间选取15例喉息肉行手术切除患者的息肉组织作为对照，分别将上述组织置液氮中保存。
1.2 主要试剂与仪器
RECK、MMP-14、VEGF引物由北京华大基因公司合成；荧光定量PCR试剂盒为TAKARA公司产品；RECK、MMP-14、VEGF抗体为北京博奥森生物技术有限公司产品；ABI 7500 Real-Time PCR仪为美国ABI公司产品；垂直板电泳、转膜仪、凝胶成像系统为美国BIO-RID公司产品。
1.3 方法
1.3.1 RECK，MMP-14 and VEGF mRNA检测 根据GenBank中报道的RECK、MMP-14、VEGF基因序列，应用DNASTAR软件设计引物（表1）；液氮罐中取出保存的组织样本，约100 mg加入1 mL Trizol，迅速研磨成匀浆液，采用Trizol法提取RNA，反转录至cDNA，用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒配伍反应体系（R.T.product 1 μL、SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL、Primer 1 1 μL、Primer 2 1 μL、H2O 7 μL），放置荧光定量PCR仪中，设置PCR热循环参数：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s收集荧光信号，40个循环。
1.3.2 RECK、MMP-14、VEGF蛋白检测 采用Western blot法检测各组织样本RECK，MMP-14 和VEGF表达水平。从液氮中取组织样本，称取100 mg，加1 mL RIPA和10 μL PMSF混合液，研磨制成乳悬液，12 000 r/min离心10 min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，加上样缓冲液，沸水煮5 min后行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭，分别加兔抗人RECK，MMP-14和VEGF抗体，4℃孵育过夜，洗膜后加HRP标记羊抗兔IgG二抗，室温下孵育1 h；TBST洗膜3次，15 min/次；ECL发光法试剂盒显色。
1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 RECK、MMP-14、VEGF mRNA检测
RECK、MMP-14及VEGF mRNA检测结果见图1，RECK基因在喉癌组织中的表达量低于喉息肉组织和癌旁组织（P < 0.05）；与喉息肉组织和癌旁组织比较，喉癌组织中MMP-14和VEGF基因的表达量明显升高（P < 0.05）。
2.2 RECK、MMP-14、VEGF蛋白检测
Western blot检测结果见图2，RECK蛋白在喉癌组织中的表达量低于喉息肉组织和癌旁组织（P < 0.05）；与喉息肉组织和癌旁组织比较，喉癌组织中MMP-14和VEGF蛋白的表达量明显升高（P < 0.05），RECK、VEGF和MMP-14蛋白在喉息肉组织与癌旁组织中的表达量差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.3 RECK、MMP-14及VEGF蛋白表达与临床参数的关系
分析喉癌组织中RECK、MMP-14及VEGF蛋白在不同年龄、性别、病理分级、淋巴转移及临床分期中的表达量具体见表2，RECK、MMP-14和VEGF的蛋白表达与病理分级、淋巴转移及临床分期有关（P < 0.05），与年龄、性别无关（P > 0.05）。
2.4相关性分析
RECK与VEGF mRNA在喉癌组织中的表达呈负相关（r = -0.907，P = 0.013）；RECK与MMP-14 mRNA在喉癌组织中的表达呈负相关（r=-0.812，P = 0.027）；VEGF与MMP-14 mRNA在喉癌组织中的表达量有显著的线性相关性，其相关系数为0.698，线性方程为Y = 0.00561+0965X（图3）。
3 讨论
细胞外基质是癌细胞在转移及微转移过程中面临的第一道屏障，MMPs在细胞外基质降解过程中发挥重要作用，与肿瘤侵袭转移机制相关，是近年来研究较多的酶类。 MMP-14位于细胞表面，属于MMPs家族中的一种特殊酶类，可降解细胞外基质蛋白。研究表明，MMP-14能够以可溶形式分泌在细胞外，降解肿瘤细胞外基质和基底膜，可通过MMP-2的激活，阻挡肿瘤细胞的浸润[9-10]。MMP-14的表达与VEGF的表达呈正相关，可以促进血管再生，在肿瘤血管生成过程发挥重要作用[11]。Chaffe等[12]用Realtime-PCR在膀胱癌中检测出MMP-14 mRNA的高表达，其表达量与肿瘤的浸润和淋巴结转移呈正相关。Wu等[13]将MMP-14转染SW626细胞系，结果癌细胞增值和侵袭能力得到抑制。本研究结果表明，MMP-14在喉癌组织中高表达，其表达量与与肿瘤的分期、淋巴结转移相关。综上推测MMP-14在肿瘤的侵袭中发挥重要作用，可促进肿瘤的生长，侵润和转移。
VEGF分裂能力较强，可以加速肿瘤细胞的增殖，促进新生肿瘤血管的形成，增加了血管通透性，为肿瘤转移创造了条件，是肿瘤形成的必要途径。研究表明，VEGF在胆管癌、大肠癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌和口腔鳞状细胞癌等组织中表达量明显高于癌旁组织[14-17]。在本研究中，喉癌组织中VEGF的表达亦高于癌旁组织，且其表达量与病理分级、淋巴转移、临床分期有关，提示VEGF蛋白可在喉癌诊断及治疗方案中发挥作用，其具备评估喉癌侵袭转移的潜能。 RECK基因是MMPs的抑制剂，可有效抑制MMP-2，MMP-4和MMP-14等MMPs家族成员的表达，在抑制肿瘤侵袭中发挥重要作用[18-20]。Kumamot等[21]研究结果表明，RECK基因的表达与肿瘤分级呈负相关，其肿瘤的恶性程度越高，RECK的表达量越低。本研究中癌旁组织和喉息肉组织中RECK mRNA和蛋白的表达量均明显高于癌组织（P < 0.05），且其表达量与MMP-14和VEGF呈负相关，与病理分级、淋巴转移、临床分期有关，提示RECK基因可以抑制MMP-14和VEGF的表达，其在抑制喉癌的浸润和转移中发挥重要作用。
综上所述，喉癌组织中MMP-14和VEGF mRNA和蛋白的表达量升高，RECK基因的表达量降低，联合检测MMP-14、VEGF和RECK基因对喉癌的诊断、临床分期的判断、喉癌侵袭具有重要意义，可作为判断喉癌生物学行为的重要参考指标；此外，这3种基因的同时检测并进一步深入研究，将有助于找到治疗喉癌浸润转移的有效靶点，为开发抗肿瘤药物和分子靶向治疗提供新选择。
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