摘 要 目的：阐明屋尘螨变应原Derp1对人肥大细胞HMC-1释放类胰蛋白酶水平的影响。方法：流式细胞法测定HMC-1细胞表面蛋白酶激活受体2（PAR2）表达水平；将Derp1、SLIGRL-NH2（PAR2激活剂）、LRGILS-NH2（PAR2对照肽）及Derp1+ FSLLY（ PAR2拮抗剂）分别处理HMC-1细胞，用ELISA检测药物刺激后类胰蛋白酶水平；采用钙绿实验检测PAR2生物学功能。结果：肥大细胞表面表达PAR2受体；Derp1单独作用于HMC-1可明显引起HMC-1细胞内钙流释放及类胰蛋白酶的释放，类胰蛋白酶释放水平明显高于SLIGRL-NH2及正常对照；将Derp1与FSLLY共同作用于HMC-1时，可部分抑制HMC-1细胞内的钙流释放及类胰蛋白酶的释放。结论：屋尘螨变应原Derp1可以通过激活人肥大细胞HMC-1表面PAR2受体引起肥大细胞脱颗粒释放类胰蛋白酶。
关键词 屋尘螨 肥大细胞 蛋白酶激活受体2 类胰蛋白酶
中图分类号：R758.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）09-0010-04
Effect of house duct mite on the degranulation of the mast cells
TANG Hui， WANG Duoqin， SHEN Yanyun， XU Jinhua*
（Department of Dermatology， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）
ABSTRACT Objective： To study the effects of the house dust mite allergen Derp1 on the secretion of tryptase from the human mast cell line HMC-1. Methods： Flow cytometry assay was performed to determine the expression levels of protease activated receptor 2 （PAR2） on the surface of HMC-1 cells. HMC-1 cells were treated with Derp1， SLIGRL-NH2 （PAR2 agonist）， LRGILS-NH2 （control peptide for PAR2） or Derp 1 + FSLLY （PAR2 antagonist）， respectively， then the tryptase levels were measured using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Biological functions of PAR2 were determined using the calcium green indicator. Results： PAR2 receptor was expressed on the surfaces of mast cells. Derp1 alone induced a significant release of intracellular calcium and tryptase in HMC-1 cells. The level of tryptase release was significantly higher compared with the SLIGRL-NH2 treatment group and the normal control group. The combination of Derp1 with FSLLY could partly inhibit intracellular calcium and tryptase release in HMC-1 cells. Conclusion： Derp1 can induce HMC-1 cells degranulation to release tryptase by activating the PAR2 receptor on the cell surface.
KEY WORDS house dust mite； mast cell； protease activated receptor 2； tryptase
肥大细胞是变态反应性皮肤病及慢性瘙痒发生中的关键细胞之一，其活化脱颗粒后可产生多种介质，如组胺、类胰蛋白酶等，其中类胰蛋白酶是重要的致痒介质[1-2]。屋尘螨是引起变态反应性疾病最常见的环境变应原之一，同时也是PAR2的激活剂[3]。因此，本实验旨在研究屋尘螨变应原Derp1对人肥大细胞HMC-1脱颗粒的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
人肥大细胞HMC-1细胞株由Dr. Butterfield 实验室（Mayo Clinic， Rochester， USA）友情馈赠，类胰蛋白酶ELISA试剂盒购自美国RND公司，SLIGRL-NH2（PAR2活化肽）、LRGILS-NH（2PAR2对照肽）和FSLLRY（PAR2抑制肽）购自Tocris公司，屋尘螨Derp1购自Abnova公司，FITC标记的羊抗鼠PAR2单克隆抗体购自Santa Cruz公司，倒置显微镜（Nikon， japan），细胞培养箱（Thermo Electron Co.， USA），胎牛血清和青霉素（Gibco），PolyL-lysine （Sigma， USA）。
1.2 人肥大细胞HMC-1 表面PAR2表达 HMC-1细胞接种于75 cm2培养瓶内，用细胞培养液[0%（v/v）胎牛血清（FBS），20 mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.01%（v/v）硫代甘油，2 mmol/L L-谷氨酰胺，链霉素和1%青霉素]于37 ℃、5%（v/v） CO2、湿度为95%的无菌环境培养箱中培养。收集对数生长期的细胞，经20 g/L多聚甲醛固定30 min后用含10 g/L BSA的PBS洗涤FITC标记的羊抗鼠PAR2 mAb以及同型对照4 mg/L 37 ℃ 孵育1 h 。抗体标记后细胞用含10 g/L BSA的PBS洗涤2次，重悬细胞以流式细胞术检测肥大细胞PAR2表达。
1.3 人肥大细胞HMC-1培养与激发[4]
收集对数生长期的细胞，用血球计数板计数， 6孔板每孔5×105，设3个重复，用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILS-NH2及100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1分别处理细胞，于30 min后终止反应，4 ℃条件下600×g离心10 min后收集上清置于一80 ℃备用。
1.4 ELISA方法检测类胰蛋白酶水平
用类胰蛋白酶ELISA试剂盒按照操作说明检测上述实验收集的上清液中类胰蛋白酶水平。
1.5 屋尘螨及类胰蛋白酶刺激下人肥大细胞HMC-1钙荧光强度的变化
将HMC-1用Poly-L-lysine固定至载玻片上，用凡士林固定在显微镜槽中，在显微镜下观察。用5 μg/ml Derp1、100 μmol/L SLIGRL-NH2、100 μmol/L LRGILSNH2、100 μmol/L FSLLY+5 μg/ml Derp1、100 ng/L类胰蛋白酶及100 ng/L 类胰蛋白酶+100 μmol/L FSLLY（PAR2拮抗剂）分别处理HMC-1细胞30 min，计算处理前后细胞内钙荧光强度的变化，将取得的数据归一化处理。
1.6 统计学方法
全部数据均采用SPSS 19.0分析，两组间比较采用t检验，P〈0.05时判定为统计学上有显著性差异。
2 结果
2.1 人肥大细胞HMC-1 表面PAR2表达
流式细胞术检测结果显示，人肥大细胞HMC-1表面表达PAR2受体（图1）。
2.2 屋尘螨变应原Derp1对人肥大细胞HMC-1释放类胰蛋白酶水平的影响
Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2细胞培养液组作用于HMC-1 30 min后类胰蛋白酶水平分别为（70.40±1.55）ng/ml、（64.45±1.36）ng/ml（24.29±2.60）ng/ml及（31.12±3.60）ng/ml。经统计，HMC-1组释放类胰蛋白酶的水平明显高于SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2和细胞培养液组（P〈0.05），差别有统计学意义。Derp1与FSLLY共同作用HMC-1 30 min后类胰蛋白酶水平为（56.72±2.66）ng/ml，较Derp1单独作用时明显降低（P〈0.05），较LRGILS-NH2和细胞培养液组依然明显增高（P〈0.05），差别有统计学意义（表1）。
2.3 屋尘螨及类胰蛋白酶刺激下人肥大细胞HMC-1表面PAR2活性测定
首先测定在细胞培养液中HMC-1的胞内荧光强度。将取得的数据归一化处理后绘制成图2所示。可以看到在30 min时胞内荧光强度下降至初始状态的72.71%±2.21%，反应了荧光淬灭的过程。分别用Derp1、SLIGRL-NH2、LRGILS-NH2、类胰蛋白酶作用于HMC-1 30 min时胞内荧光强度下降至初始状态的100.30%±2.37%、82.38%±2.24%、72.77%±3.16%、89.95%±2.25%。用Derp1+FSLLY，类胰蛋白酶+FSLLY作用于HMC-1 30 min时胞内荧光强度下降至初始状态的78.63%±3.15%及82.60%±3.29%。
3 讨论
皮肤瘙痒是皮炎、湿疹、荨麻疹、 接触性皮炎、 结节性痒疹和特应性皮炎等过敏性皮肤疾病最常见的临床表现，严重影响患者的生活质量， 需要及时有效的治疗[5]， 然而，皮肤瘙痒的发病机制至今仍不清，导致抗瘙痒治疗效果有限。相关研究发现吸入性的变应原（主要是屋尘螨和粉尘螨）是引起过敏性皮肤病的重要诱因[6] ，在具有慢性瘙痒的过敏性皮肤病中，持续性的接触屋尘螨与疾病的加重有关[7]。现有研究发现屋尘螨的提取物通过活化PAR2，可导致呼吸道黏膜下腺体的分泌增加，并可引起肺的感觉神经元细胞内钙离子内流增加[8]，由此可见屋尘螨可以通过与PAR2的作用参与疾病的发生。
蛋白酶激活受体（PARs）属于与G蛋白偶联受体家族，这个家族有四个成员：PAR1， PAR2， PAR3和PAR4。PAR2分布于各种组织和细胞表面，主要包括人皮肤肥大细胞，上皮细胞，活化的内皮细胞，肌细胞，神经元和星形细胞等[5，9]。肥大细胞又是瘙痒发病中的关键细胞之一，其释放的组胺和类胰蛋白酶都是重要的致瘙痒的介质，其中以类胰蛋白酶的含量为最大，约占肥大细胞分泌颗粒中蛋白质总量的1/2。由此可见，肥大细胞表面存在PAR2受体，而屋尘螨可以通过与PAR2的作用参与疾病的发生，因此我们推测，屋尘螨可以通过活化肥大细胞表面的PAR2受体进一步引起类胰蛋白酶的释放，从而导致瘙痒的发生。有效地阻断这一环节可能是治疗慢性瘙痒尤其是对抗组胺药效果不佳的瘙痒的潜在靶点，因此我们针对屋尘螨变应原-PAR2信号通路-肥大细胞-类胰蛋白酶途径进行研究，以期阐明这一途径的分子机制。
本实验研究通过流式细胞检测法证实HMC-1细胞表面PAR2受体的存在。屋尘螨变应原Derp1单独作用于HMC-1细胞可明显引起HMC-1细胞脱颗粒释放类胰蛋白酶，其水平明显高于PAR2活化剂、PAR2对照肽及正常对照，表明屋尘螨变应原Derp1是人肥大细胞HMC-1活化的重要刺激物。而将屋尘螨变应原Derp1与PAR2拮抗剂FSLLRY共同作用于HMC-1细胞时，可部分抑制HMC-1细胞脱颗粒引起的类胰蛋白酶的释放。PAR2激活的一个重要特征在于诱导细胞内钙流释放，本研究通过检测HMC-1细胞内钙荧光强度的变化，发现Derp1及类胰蛋白酶可明显引起HMC-1细胞内钙流释放，这一作用可部分被PAR2拮抗剂FSLLRY所拮抗。因此，我们认为屋尘螨变应原Derp1可以通过激活人肥大细胞HMC-1表面PAR2受体引起肥大细胞脱颗粒释放类胰蛋白酶，但这并不是唯一途径。
慢性瘙痒性皮肤病的治疗一直是临床的难题，由于其发生机制并未完全明确，因此蛋白酶抑制剂、PAR2拮抗剂等理论上可以抑制瘙痒的药物均尚未应用于临床治疗，对其的研究多仅停留在动物实验阶段。对于我们课题中这些问题的解答将有助于明确慢性瘙痒的新靶点，也有助于明确屋尘螨变应原-PAR2信号通路-肥大细胞-类胰蛋白酶这一途径在慢性瘙痒中所发挥的作用及其分子机制，从而为临床新的治疗提供切实的理论基础，为真正解决临床实际问题提供帮助。
参考文献
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