研究[1]认为，肺间质纤维化的发生、发展是胶原蛋白等细胞外基质( ECM) 合成与降解不平衡的结果，在ECM 降解中，基质金属蛋白酶( matrixmetalloproteinase，MMP) 起非常重要的作用。近年来研究发现，肺泡上皮基底膜的完整对保证肺组织结构正常修复起着至关重要的作用。肺泡上皮基底膜是一种特殊的ECM 形式，Ⅳ型胶原是其重要组成成分，以Ⅳ型胶原为作用底物的MMPs 主要有2 种，分别是MMP-9 和MMP-2，其中MMP-9 的作用我们已经进行了研究，本实验主要以MMP-2为研究指标，采用逆转录-聚合酶链反应( RT-PCR) ，观察博莱霉素所诱导的大鼠肺纤维化不同时间点MMP-2mRNA 的动态变化，以及银杏叶提取物对MMP-2mRNA 表达的影响，探讨MMP-2 在博莱霉素所诱导的大鼠肺纤维化的发生、发展中的作用以及银杏叶提取物的治疗效应。报告如下。
1 材料
1. 1 实验药物
博莱霉素( 平阳霉素，Bleomycin A5，BLMA5;天津太河制药有限公司生产，批号040601) ，每支8 mg，用1 mL 生理盐水配置备用。醋酸强的松片( 广东华南制药厂生产，批号041201) ，在使用时用蒸馏水溶解，配成0. 32 g /L 混悬液备用。银杏叶提取物选用依康宁片( 扬子江集团有限公司生产，批号05012801，每粒含总黄酮醇苷19. 2 mg，萜类内酯4. 8 mg，剂量按照总黄酮醇苷与萜类内酯总剂量计算) ，用蒸馏水溶解制成0. 675 g /L 混悬液备用。
1. 2 主要试剂及仪器
氯仿( 天津市博迪化工有限公司) ，DEPC、无水乙醇及异丙醇( 上海振兴化工厂) ，Trizol( 购自Gibco 公司) ，反转录及PCR 试剂盒购自Takata 公司，Marker，上样缓冲液Loading Buffer，琼脂糖，溴乙锭。
PCR 扩增仪、高速低温离心机、电泳仪、5 mL 匀浆器、微量移液器、液氮、- 70℃ 冰箱、UVP-GDS8000 凝胶成像分析系统( Ultra-Violet，美国) 。
MMP-2 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，产物大小为400bp，上游引物5CACCATCGCCCATCATCAAGT 3，下游引物5TGGATTCGAGAAAAGCGCAGCGG 3 内参照GAPDH，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，产物大小为450bp， 上游引物5 ACCACAGTCCATGCCATCA 3 ， 下游引物5 TCCCACCACCCTGTTGCTGT 3。
2 方法
2. 1 实验动物及分组
96 只健康Wistar 大鼠，体重( 180 20) g，清洁级，雌雄不限，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号TJLA [2005]011，于实验前1 周一次性购进，按清洁级标准饲养于安静、温暖且避强光的环境中，自由饮水进食。大鼠随机分为正常对照组( A 组) 、模型组( B组) 、强的松组( C 组) 和银杏叶提取物干预组( D组) ，每组各24 只。
2. 2 建立模型
B、C、D 组采用经气管滴注博莱霉素( BLM)建立大鼠肺纤维化模型。10% 的水合氯醛10mg /( kgbw) 腹腔注射麻醉大鼠，将其仰卧固定于大鼠实验台上，切开颈部皮肤，分离气管，正常组一次性气管内注入生理盐水1 mL /( kgbw) ，其余3 组一次性气管注入等容积BLM _ A55 mg /( kgbw) ，注射后立即将动物直立并旋转，使药物在肺内均匀分布，尔后缝合皮肤，置动物于实验动物室内喂养。
2. 3 给药方法
造模第2 天起D 组每天用银杏叶提取物( 浓度0. 675 g /L，剂量为10 mL /kgbw) 灌胃1 次; C组用醋酸强的松混悬液( 0. 56 mg /kg) 灌胃1 次;A、B 组每天用生理盐水( 10 mL /kgbw) 灌胃1 次。
2. 4 标本采集及处理
按RT-PCR 实验常规对实验器具及工作台用DEPC 进行处理。将各组大鼠摘除眼球放血处死后，开胸取肺组织，取左下肺组织块100 mg 置于EP 管中，然后将EP 管迅速置于液氮中。
2. 5 检测方法
第1 步: 抽提RNA。
第2 步: 逆转录( reverse transcriptase，RT)
( 1) RT 第1 步，反应体系8l 65℃ 15 min，然后立即放入冰浴;
( 2) RT 第2 步，在第1 步基础上续加以下试剂，反应体系20 L 37℃ 1 h，94℃ 5 min，反应物作为cDNA 模板进行PCR。
第3 步: 聚合酶链式反应( Polymerase ChainReaction，PCR) 。以RT 反应的产物作为CDNA 模板，反应体系25 L 94℃ 45 s，56℃ 50 s，72℃90 s 30 个循环; 72℃ 10 min; 取出后4℃ 5 min 后电泳。
第 4 步: 电泳。
2. 6 图像分析
电泳条带采用UVP-GDS8000 凝胶成像系统( Electrophoresis documentation and Analysis System，USA) 做积分光密度( IOD) 测定，并分别以各组目的基因与内参GAPDH 的IOD 比值来衡量各时间点MMP-2mRNA 表达的相对含量。
2. 7 统计学方法
采用PEMS3. 1 统计软件进行数据处理，计量资料用均数 标准差( 珋x s) 表示，组间比较用t检验，P 0. 05 表示差异有统计学意义。
3 结果
大鼠肺组织MMP-2mRNA 动态变化的相对定量结果显示，各实验组在第7、14、28 天3 个时间点均有MMP-2mRNA 的表达，与A 组相比，B 组第7 天含量显著升高( P 0. 01) ，第14 天时达到高峰，第28 天虽较第7、14 天时有所降低，但仍明显高于A 组同期( P 0. 01) 。与B 组比较，C 组和D 组各时间点含量均明显降低( P 0. 01) 。
4 讨论
肺间质纤维化的发病率逐年上升，但由于其发病机制尚未阐明，治疗效果不尽人意。近年来，众多学者越来越重视对ECM 降解的研究，认为肺间质纤维化是ECM 合成与降解不平衡的结果，其中MMPs 起着十分重要的作用。根据降解的底物不同，MMPs 可分为3 大类: ( 1) 间质胶原酶和中性粒细胞胶原酶，降解间质型胶原( 主要为Ⅰ、Ⅲ型胶原) ; ( 2) Ⅳ型胶原酶( MMP-2 和MMP-9) ，降解基膜型( Ⅳ型) 胶原和变性的间质型胶原( 明胶) ; ( 3) 基质降解素，降解蛋白多糖、层粘连蛋白( laminin) 、纤维连接蛋白( fibronection) 和Ⅳ型胶原[2]。研究[3]发现博莱霉素引起的Ⅳ型胶原变化与Ⅰ、Ⅲ型胶原变化不同，Ⅰ、Ⅲ型胶原的异常表达，主要发生于肺纤维化的中、后期，而Ⅳ型胶原的变化在肺纤维化早期就非常突出，表现为Ⅳ型胶原溶解、基膜断裂，接着Ⅳ型胶原的含量增多。
MMP-2 以Ⅳ型胶原为作用底物，Ruth 等[4]在博莱霉素诱发小鼠肺纤维化的实验中发现，用药后24 h 肺组织MMP-2mRNA 表达增高2 ～ 3 倍，并一直维持于高水平达2 个月。卢韶华等[5]通过研究进一步发现，肺纤维化早中期MMP-2 的主要来源是肺间质成纤维细胞，使肺内成纤维细胞MMP-2 表达持续增高的原因可能是多方面的，病变早期可能为致纤维化因素的直接作用，以后有巨噬细胞等分泌的细胞因子的调节，增多的MMP-2 在MT1-MMP 作用下活化[6]，提示MMP-2 的过度活化可能是肺基膜Ⅳ型胶原蛋白降解的内在原因，是肺纤维化启动的重要机制。随后病程中沉积的ECM 也可刺激MMP-2 的表达[7]，较高的MMP-2活性水平可能与损伤的持续化相关，既促进了肺间质纤维化的进展，也参与了损伤修复过程的组织改建。
本实验结果显示，各组在第7、14、28 天3 个时间点均有MMP-2mRNA 的表达，与A 组相比，B组第7 天含量显著升高，第14、28 天虽较第7 天有所降低，但仍明显高于同期A 组，表明MMP-2的过度活化可能是肺间质纤维化的启动因素之一，监测MMP-2mRNA 的含量变化可以了解肺间质纤维化的发生、发展进程。与B 组比较，C 和D 各组各时间点含量均明显降低，说明强的松和银杏叶提取物能够有效抑制MMP-2mRNA 的过度表达，降低MMP-2 的活性，对肺间质纤维化的发生、发展起到一定的防治作用，特别是银杏叶提取物组，这种作用表现的更明显。
通过对实验结果的分析，可以得出如下结论:银杏叶提取物能够有效抑制MMP-2mRNA 的过度表达，从而对肺损伤和肺间质纤维化起到一定的防治作用。
