芸苔属植物中包括许多重要的蔬菜作物,如大白菜、青菜、甘蓝、花椰菜、青花菜等,这些蔬菜与人们的日常生活密切相关,在农业生产上占有一定的地位。常规育种方法在蔬菜育种中已经取得巨大成就,但由于其局限性不能利用存在于完全不同的其它物种中的基因资源,而这些资源在近亲中又难以找到,使人们迫切希望的一些育种目标难以实现。应用植物基因工程技术则可以突破物种间的界限,转移外源的有用基因,为进一步改良品种提供新的育种手段。
转基因植物的研究始于70年代末、80年代初,当时仅在少数植物种上由野生型的Ri和Ti质粒转化的细胞再生出植株。1983年Zambryski等,1984年De Block等分别报道用切去瘤基因的根瘤农杆菌(At)及发根农杆菌(Ar)进行基因转移,获得形态正常的转基因植株。1985年Horsch等人首创了叶盘法,用At感染烟草外植体,获得转基因烟草。迄今为止,全世界已分离目的基因数百个,获得120多种转基因植物,3000多例转基因植物被批准进入田间试验,至1998年止已批准30种植物投放市场。植物基因工程对农业发展的重要性举世瞩目。
目前已研制出多种基因转化技术,如农杆菌介导法、基因枪转化法、PEG介导转化法、电击穿孔转化法、显微注射转化法、激光微束转化法、植物生殖细胞转化法、超声波转化法、脂质体介导转化法、病毒介导转化法等。其中,以农杆菌介导的基因转化系统的应用最为广泛,在已获得的转基因植物中80%是采用这一转化技术。
一、芸苔属蔬菜转基因技术研究进展
近几年来芸苔属蔬菜基因转化研究取得了显著进展,但也存在一些问题,下面分别介绍芸苔属蔬菜离体培养植株再生受体系统和基因转化体系的研究现状。
1. 芸苔属蔬菜离体培养植株再生系统
(1)激素对外植体不定芽诱导的影响
在植物离体培养中,外源细胞分裂素和生长素对不定芽的诱导和生长发育起着重要作用。基因型不同,诱导不定芽的难易程度不同,对激素种类和配比的要求也不同。甘蓝、花菜的不定芽诱导相对容易,通常在培养基中添加IAA、NAA、IBA等生长素类激素并配合细胞分裂素6-BA,ZT,即可获得较高的植株再生频率[1,3,5,6]。青菜、大白菜的不定芽诱导较为困难,有关研究表明,这是由其遗传上的A组染色体所决定的。以往的研究使用较传统的腺嘌呤类细胞分裂素,进展缓慢。本课题组选用了近年来才引起人们注意的苯基脲类细胞分裂素CPPU,青菜、大白菜的不定芽诱导频率明显提高[2,8]。最近王凌健等在青菜组织培养中使用了另一种苯基脲类细胞分裂素TDZ[7],同样取得了较好的效果。苯基脲类细胞分裂素的应用是近年来青菜基因转化取得突破的重要原因之一。
(2)AgNO3对不定芽诱导的促进作用
乙烯作为一种重要的植物激素和其它激素一样,对组织培养中不定芽的诱导有着重要的影响。Pau等成功地将反义ACC氧化酶基因通过农杆菌介导法导入Brassica juncea,使得转基因植株当代及其后代外植体ACC氧化酶活性下降,在离体培养过程中乙烯释放量明显下降,而不定芽诱导频率大幅上升,证明不定芽的形态发生受到有关乙烯合成的调节基因控制。有关研究报道,大白菜离体培养之所以难以获得再生植株,与其外植体培养过程中产生大量乙烯有关,银离子可以竞争性地结合乙烯受体从而消除乙烯对不定芽形态发生的抑制作用,进而提高离体培养再生不定芽诱导频率。因此近年来在芸苔属蔬菜离体培养中,许多研究者开始在培养基中添加AgNO3,使得许多原先难以再生的青菜、大白菜和甘蓝的一些基因型的不定芽诱导频率大幅度提高[2,4,5,7,8]。
(3)外植体种类与苗龄
不同外植体材料,由于其内源植物激素的平衡状态的差异,使得不定芽诱导频率不同。例如Ondre等人在烟草中的试验结果表明,当烟草外植体中导入有关细胞分裂素合成的调节基因ipt时,转化的组织就成为苗性表达瘤;而导入有关生长素合成的调节基因iaaM和iaaH时,转化的组织显示出根性表达瘤。因此选择
适当的外植体材料是非常必要的。芸苔属蔬菜离体培养的外植体通常包括叶片、下胚轴、子叶、子叶柄等。据研究,大白菜、青菜以子叶外植体不定芽诱导频率为高[2,4,7,8],甘蓝、花菜一般以下胚轴为高[1,5,6,9]。无菌苗的苗龄通常以4-8天较为适宜[1-9]。
2.芸苔属蔬菜基因转化体系
(1) 抗生素的选用
外植体与农杆菌共培养是近年来获得芸苔属蔬菜转化植株的主要途径(表1)。在共培养之后必须使用抗生素杀死农杆菌,否则由于农杆菌的过度繁殖造成外植体切口处转化细胞的死亡和不定芽诱导的困难。通常使用的抗生素有头孢霉素和羧苄青霉素。在甘蓝型油菜的外植体与根癌农杆菌共培养转化中,Cherest等和De Blook等曾观察到头孢霉素对外植体材料有毒害作用,会抑制植株的分化。本课题组的研究表明,头孢霉素抑制甘蓝、青菜、大白菜的不定芽诱导[1,2,7,8],羧苄青霉素则对青菜、大白菜不定芽诱导有促进作用[2,8],对甘蓝下胚轴诱导不定芽无抑制作用[1],因此在芸苔属蔬菜基因转化中宜选用羧苄青霉素杀死农杆菌。但羧苄青霉素不利于生根[3],因此在生根培养基中不添加羧苄青霉素,或者降低用量。
(2) 转化体筛选
在芸苔属蔬菜的基因转化中最常用的筛选标记基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPT II),该基因可以使转化细胞产生对卡那霉素的抗性。Pua等用根癌农杆菌转化甘蓝型油菜茎的纵切片,在卡那霉素选择培养基上分化不出茎芽,因而认为卡那霉素有可能影响转基因植株的获得。本课题的研究结果表明,卡那霉素抑制青菜[2,7]、大白菜[8]、甘蓝[1]的不定芽诱导,影响了基因转化工作的开展。为此,我们采取先在含有较低浓度卡那霉素的培养基上诱导不定芽,在不定芽增殖培养过程中再提高卡那霉素的浓度;或者农杆菌感染后的外植体材料先在无卡那霉素的不定芽诱导培养基上培养,待不定芽诱导发生后再将不定芽或幼苗转移到含卡那霉素的生长培养基上,进行筛选,淘汰非转化植株。这一技术措施既克服了植株再生的障碍,又起到标记基因的筛选作用。采用这种方法,已从青菜矮脚黄、苏州青、973、中脚黑叶和矮脚黑叶,大白菜夏丰42和426,结球甘蓝鸡心23和黑叶头获得一批具有卡那霉素抗性的转化植株。
(3) 外植体在农杆菌菌液中浸泡时间
芸苔属蔬菜外植体对农杆菌较为敏感,农杆菌感染后伤口处的细胞易因过敏性反应而导致褐化,严重影响不定芽诱导和基因转化频率。卫志明等[5]对甘蓝的研究结果显示,当下胚轴切段与农杆菌感染时间超过5-10分钟时,下胚轴切段在转化后极易褐化死亡,不定芽诱导频率大幅下降。因此,芸苔属蔬菜基因转化中普遍采用1-5分钟的浸泡时间[1,2,3,5,7,8]。此外,卫志明等将甘蓝下胚轴先预培养2-3天,再进行基因转化,明显减轻了褐化现象,不定芽诱导频率大大提高[5],说明适当时间的预培养有利于基因转化效率的提高。
二、芸苔属蔬菜的转基因工程植株
(1) CpTI基因
本课题组开展了甘蓝[1]、大白菜[8]、青菜[2]的转CpTI基因研究。三年来,先后从不结球白菜矮脚黄、苏州青、973、中脚黑叶、矮脚黑叶,大白菜夏丰42、426,结球甘蓝鸡心23、黑叶头中得到具有卡那霉素抗性的转基因植株。PCR和Southern blot分子检测证明抗虫目的基因桟pTI基因已导入转化植株。不结球白菜矮脚黄、大白菜夏丰42、结球甘蓝鸡心23和黑叶头转基因当代植株在温室内连续放虫试验中均表现出具有不同程度的抗虫性能。结球甘蓝鸡心23转基因植株自交后代(T1代)植株在田间自然条件下和人工喂虫试验中,观察到抗虫性状的分离现象,并从T2代中选出抗虫性表现一致的株系。此外,已从不结球白菜中脚黑叶、矮脚黑叶,结球甘蓝黑叶头转基因植株自交后代(T1代)植株中选择出抗虫性遗传的单株。
方宏筠等(1997)[6]将CpTI基因导入甘蓝栽培品种“京丰”和“迎春”,试验表明卡那霉素抗性筛选、ELISA检测、NPTII检测、Southern blot检测结果具有高度的一致性。抗虫性试验结果显示3个转基因无性系抗虫效果存在明显差异,同一无性系的不同植株也明显差异,这表明外源基因在转基因植株中的表达调控机理是复杂的,有待深入研究。
(2) Bt基因
卫志明等(1998)[5]将Bt基因导入甘蓝栽培品种“夏丰甘蓝”的母本及父本中,Southern blot杂交结果表明,该试验的甘蓝基因转化中多数是单拷贝数的整合,少数为2个和3个拷贝数的整合。
(3)TI基因
Ding等(1998)[9]将从甘薯中克隆出来的TI基因导入花椰菜,对转基因当代植株DNA进行PCR扩增获得0.66kb DNA片断,与TI cDNA探针杂交证明这些片断具有TI基因序列,在所有6个转基因植株中均检测到分子量为24KD的TI基因表达产物。田间抗虫性试验表明转基因植株对当地的两种害虫Spodoptera litura 和 Plutella xylostella 具有较好的抗虫效果。R1和R2代的遗传分析工作正在进行中。
(4) MTII基因
陈淑惠等(1998)[10]将分离自天竺鼠的镉结合蛋白基因(MTII),利用农杆菌介导法转入青花菜,Southern blot分析结果显示MTII基因已导入青花菜,试验还表明启动子为rbcS时,表达量及耐镉能力高于启动子为CaMV35S时。
(5) 生长素合成酶基因
姜翌等(1998)[11]将该基因导入甘蓝,M2代植株结球提前,侧根数增多;腋芽扦插时不定根发生早而多,下胚轴在离体条件下培养时会自然发生大量不定根。
(6) 抗黑腐病基因
廖芳心等(1998)[12]通过花粉管导入法将该基因导入甘蓝,据试验,237株后代中56株呈抗病性反应。
(7) capsid基因和CaMV基因
Passelegue等(1996)[13]通过农杆菌介导法将capsid基因和CaMV基因导入花椰菜,T-DNA在植株基因组中的整合具有多拷贝情况,在转化capsid基因的植株中未检测到病毒外壳蛋白。
(8) NPTII基因和GUS基因
这两个基因为报告基因,一些研究报道了单独转上述报告基因的结果。现有Christey等(1997)[14]将NPTII基因导入甘蓝,Takasaki等(1997)[15]将NPTII和GUS基因导入不结球白菜等5篇报道。