摘要 基因工程的诞生和发展是与基因转移方法的出现和发展分不开的。为了实现不同的目标，就需要各种各样的基因转移方法。一般来说，向植物中转移基因，存在的困难要比微生物和动物多些；但由于植物基因工程对作物改良的重要性，近年来获得了迅速发展，各种基因转移方法层出不穷。本文系统地介绍了现有的植物基因转移方法 关键词 基因转移方法 外源基因 Ti 质粒 共培养 载体 转基因植物
植物基因工程是在分子生物学深入发展和重组DNA技术日趋完善的基础上发展起来的。在植物抗病、抗虫、抗莠和改变植物的某些成分方面得到不少转达基因植物，有的已形成品系，为提高作物产量、抗逆能力、改进品质，进行快速、优质、稳产的良种选育提供了全新途径。 在高等植物基因工程研究中，外源基因的转移是极为重要的一环。由于植物及其细胞自身的特殊性，因而对基因转移方法也有一些特殊的要求。纵观诸多外源基因转移方法，按照载体的形式可以分为两大类：即用含外源基因Ti质粒的根癌农杆菌侵染植物和用含外源基因的DNA直接转化植物。
１ 以根癌农杆菌Ti 质粒为载体的转化 根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性细菌，可以通过伤口感染受伤后的双子叶植物，使植物受创伤的部位组织增生，形成冠瘿瘤。农杆菌中含有一种独立于染色体之外，并在农杆菌细胞中稳定遗传的环状DNA，即Ti 质粒。在根癌农杆菌感染植物时，Ti 质粒的一段DNA（T-DNA）可以转移进植物细胞，并稳定地保留在植物细胞染色体中，变为植物细胞新增加的一群基因，最终能通过有性世代遗传给子代。在大多数情况下，野生型的农杆菌Ti 质粒诱发的肿瘤或转化的细胞，由于T-DNA基因产物引起植物激素的不平衡，难以再生正常的植株，这就使得转化特性难于通过种子代代相传。因此，必须将Ti 质粒加以修饰和改建，即使某些基因缺失，又不致影响其转化和表达的功能。
1973年，美国斯坦福大学的科恩（Stanley Cohen）和加州大学的博耶（Herbert Boyer）等人，将带有抗四环素基因的质粒Psc101和来自鼠伤寒沙门氏菌质粒RSF1010（带有抗链霉素和磺胺基因），用内切酶和连接酶进行切割和拼接，构建成一个新的DNA分子即杂种质粒。用它转化大肠杆菌后，转化子既抗四环素，又抗链霉素。随后，Vanlare等（1974），沃森（Watson）等（1975），Zaenen等（1971）经过不断的努力，使利用Ti 质粒作为植物外源基因转移和表达的载体成为可能。其中的关键是改造Ti 质粒，他们所做的工作是去掉Ti 质粒上有致瘤作用的那段基因，并保持其T-DNA的转移能力和外来基因在再生植物中的表达能力。这样，植物在受到经过改造的Ti 质粒侵染之后分化成正常植物而不是肿瘤，这个人工修饰过的Ti 质粒（即Ti 质粒衍生载体），就成为一个能把基因引进植物的万能载体。 利用Ti 质粒衍生载体进行基因转移的方法有以下几种:
（1） 原生质体共培养法 由于原生质体具有遗传上的一致性与稳定性，又有“第二种子”之称；再加上它无细胞壁而易于接受各种外来遗传物质，所以就成为使用最早和应用最广泛的受体系统。将预培养2～3天的原生质体与含有改造过的具有所需外源基因Ti 质粒的根癌农杆菌液混合，在培养基中保温一定时间，然后离心收集原生质体，并加以培养直至再生成s完整植株。
（2）植物组织，器官共培养法 以植物组织和器官作为基因转移受体是因为植物伤口对根癌农杆菌的感染特别敏感，而且创伤部位正是细胞快速分裂和诱导长芽的地方，因此转化细胞成苗录较高。除此以外，还基于下边考虑：1，不是所有植物都容易从原生质再生成植株。2，从植物组织和器官再生成植株周期短；3，再生植株组织和突变录或染色体崎变录较低。这一方法是以Horsch 的“叶盘法”为基础的将人为造成伤口的叶片，上下胚轴，茎段，根段等在根癌农杆菌液中浸泡数秒钟到数分钟，然后共培养2—3天，再经过组织培养即可获得再生植株此方法操作过程简单有效，原则上可以转化所有可以从叶片上等再生成植株的双子叶植物。迄今为止，在烟草等作物上获得的抗病虫转基因植物基本上是这样产生的。 此外，也可用整植株水平转化法：即在幼苗期植株茎部切口处进行活体接种，然后将创伤表面长出的愈伤切下进行离体培育。 以上用根癌农杆菌感染植物细胞的方可能会受到宿主范围的限制，因为虽然也有少数成功的报道，但一般认为根癌农杆菌难以克服。
（3）植物原生质体和农杆菌原生质球的融合转化 用溶菌酶处理农杆菌，去除其细胞壁，使杆状的细菌转变为球形的原生质。然后在诱导剂的帮助下与植物受体原生质体融合，从而使根癌农杆菌的质粒DNA与植物细胞DNA重组。 这种转化方法有许多优点。一方面，不必花费时间去提取和纯化Ti质粒，而且农杆菌的原生质还可保护其内的Ti质粒免受核酸酶的攻击。另一方面，由于该过程只是融合的过程而不是感染的作用，这就有可能不受宿主范围的限制而成为单子叶植物的转换方法。 自然界中还存在着一些其他的基因转移的天然载体，如发根农杆菌及其Ri质粒。虽然Ri质子的T—DNA基因的结构和基因表达与Ti质粒有很多不同之处，但它与Ti质粒在转化植物细胞的机能上很相似，人们所用的转化方法十分类似。虽然对Ri质粒毒性小，且转化的毛状根很容易形成愈创伤组织和再生成形态上正常的植株，所以近几年进展很快。
2 含外源基因DNA的直接转化 DNA直接转化是用物理，化学和生物手段将裸露的外源DNA导入植物细胞，并使外源DNA所包含的基因在植物细胞内进行表达。这一方法从根本上克服了Li质粒只能侵染双子叶植物的缺陷，使受体植物范围大大扩展。
2.1化学法 植物原生质体在没有栽体的情况下，借助一些化学试剂的诱导能吸收外源DNA，质粒等遗传物质，并有可能整合到植物染色体上去。常用的化学试剂有PEG（聚乙二醇），PLD（多聚鸟氨酸），PVA（聚乙稀醇）等，其中最为常用的是PEG。应用这一方法，在植物细胞中首次进行直接基因装移的是戴维(Davey)和Krens等。化学法打破了根癌农杆菌侵染范围的限制，使之可以广泛应用于多种单子叶的禾谷类植物，目前已实现了对栽培一粒小麦，多年生黑麦，水稻，高粮和小麦等原生质体以及双子叶植物油菜，烟草和矮牵牛的转化。但单独应用化学法进行转化较难成功，若与其它方法（如下面将介绍的电激法，基因枪等方法）结合应用，转化效率可大为提高。希利托(Shillito)等（1985）将PEG及电激法结合起来，使烟草原生质体转化录达2%，比单独使用PEG效率提高了1000倍。
2.2电激法 这是一种正在广泛使用的新方法，最初是由弗罗拇（FROMM）报道的，并由李宝健步1985年首先应用于植物 细胞。将原生质体在溶液中与DNA混合，然后使其受短脉冲电流的作用，质体已再生出可育的转基因水稻和玉米植株。电激法在植物细胞的基因转化中具有很大潜力，不但原生质体而且完整的单细胞也可利用此法，这对于那些难以从原生质体再生植株的植物或许有更大意义。此外，激光微束技术与电激法的原理及效果都极为相似。
2.3 微注射法 它是将外源DNA直接注入植物细胞的方法，其发展在很大程度上得益于动物细胞粘附于玻片表面生长的特性，但由于植物细胞没有这一特性，于是人们边试图先将植物细胞进行固定，常用的方法有：（1）琼脂糖包埋法。（2）聚赖氨酸粘连法。（3）吸管支持法。然后用非常精细的玻璃管（内径0。1~0。5um）把DNA直接注射到固定好的单个活细胞中。这一操作过程需要借助一个由显微镜和一个纤细的微型操作器构成的精致装置才能完成。微注射的一个缺点是被注射的细胞数量较少，不过在每个被注射的细胞中DNA插入的成功率较高。据Corssway等对烟草原生质体进行的微注射结果，平均转化率高达6%（胞质注射）和14%（核内注射）：用此法还成功地转化了苜蓿和玉米原生质体。此外，显微注射法应用于花粉、卵细胞或其它胚胎类组织，也克服了用原生质体作受体带来的培养上的困难。我国学者曾用授粉的子房为受体，用显微注射方法将克隆的玉米醇溶蛋白基因注入水稻的胚囊中，再生的植株中有玉米醇溶蛋白的基因。
2.4 花粉管通道法 最早是由周光宇1983年建立。在植物授粉后一定时间，将外源DNA注入棉花子房的中轴胎部位，使DNA沿着已形成的花粉管通道进入胚囊，从而转化尚不具备正常细胞壁的受精卵或胚细胞，转化率高达10%。这一方法的建立开创了整株活体转化的先例。 另外，De La Pena 1987年又将外源DNA注射到黑麦的分蘖节上，也获得了转基因黑麦植株。目前，花粉管通道法已在水稻、棉花、玉米、大豆上获得转基因植物。
2.5 基因枪法 克莱因（Klein）等1987年首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入其中，并实现了外源基因在完整组织中的表达。这一方法要使用一种防枪结构的装置——基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm左右的小孔，弹头不能通过。其具体操作是将直径4um左右的钨粉或其它重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面，再把这些吸附有外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端，起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。这一方法与微注射法相比，具有一次处理可以使许多细胞转化的优点，受体可以是植物组织也可以是细胞。应用此方法，已获得了玉米、小麦、水稻的转化细胞和烟草、大豆等可育的转化植株。另外，也有对未成熟胚进行轰击并实现转化的报道。
2.6 脂质体法 将磷脂悬浮在水中，在适当条件下，受到高能声波处理时，磷脂分子群集在一起形成密集的小囊泡状结构，称为脂质体。在其中包裹一些DNA、RNA分子就成了一种人工模拟的原生质体，它的外膜相当于人造的细胞质膜。如果将脂质体与植物原生体在适当的培养基中混合，两者之间便会发生内吞作用、融合作用或交换作用，使得脂质体或其内含物被吸入植物原生质体。随后再与溶酶体融合，并逐渐被降解，使内含物释放出来。这样就可以使被包裹的核酸传递到各种类型的细胞中，这就是以脂质体为介导的核酸传递途径。
上面介绍的均是当前的植物基因工程工作中较为成熟的和有成功报道的基因转移方法，每种方法都有自身的优点，但也有一些不足或者在应用范围上存在一些限制。 今后，探索基因转移的途径似乎可以从以下三个方面进行考虑：第一，挖掘以有方法的潜力，扩大其应用范围并使之更加完善。第二，将几种方法结合使用，以取得单一的方法难以达到的效果。第三，探索的方法和寻找的载体。
注:1.共培养法: 2.化学法: 3.电激法: 4.微注射法: 5.花粉管通道法: 6.基因枪法: 7.脂质体法: 8.植物原生质体与农杆菌原生质球的融合转化法 3 参考文献 邓万银等.致瘤农杆菌能够转化大麦和小麦.中国科学, (B辑). 1989.2: 171---175 2 Charles S.G. Robert T.F. Genetically engineering plants for crop improvement. Science. . 244: 1293~1299 3 Horsch R. B. et al. A simple and general method for transferring genes into plants. Science. 1985,217:1229~1231 Horst L. et al. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast Transformation. MGG. 1985. 199:178. Ingo P. et al. Direct gene transfer to cell of a graminaceous Monocot. Ibid. 1985. 199:183~185.
