(一)母种的制备
用试管制成斜面培养基，并接种原始试管种(保留种，并用于生产的母种即为生产母种，可用于扩接原种。
1．培养基配方
配方一综合马铃薯培养基
马铃薯200克葡萄糖20克磷酸氢二钾2克硫酸镁0.5克
维生素B110毫克琼脂20克水1000毫升PH值自然
配方二合成培养基
马铃薯20克葡萄糖20克磷酸二氢钾2克蛋白胨10克牛肉膏5克
酵母膏5克硫酸镁0.8克水1000毫升PH值自然
2．培养基制作方法
先将马铃薯洗净去皮切成簿片，称取200克，加水1000毫升，煮沸15—20分钟，用4层纱布过滤，取其滤液并补足水至1000毫升，加入琼脂20克，再加热，琼脂溶化后，再加入其它配方中的药品。
培养基的分装，应在培养凝固前进行（琼脂培养基40℃凝固）一般用漏斗，或分装瓶，下端连接一段软橡皮管，橡皮管下面再连接一水段玻璃管，在橡皮管上安装一个止水弹簧夹，分装时将玻璃管细口插入试管内，但不要碰到管壁，每支试管装入量为度管长度1/4。装好后塞上棉塞，每10支试管扎一捆，棉塞上用塑料纸封扎好，用线绳捆扎起来。
3．灭菌
将分装后的试管扎捆好，放入高压蒸气灭菌锅，在1公斤/厘米压力下(锅入温度达121℃)灭菌20分钟使微生物包括芽子色全部杀死。待压力降到0度时，慢慢放出锅内气体，趁培养基没有凝固时，将试管摆成斜面。
4．接种、培养
通过无菌操作方法将菌种接入试管斜面上，置28℃、3天后将温度降至24℃继续培养，12—15天左右，菌丝长满整个试管斜面，即成(生产)母种。
(二)原种、制备
母种接种到原种培养基上，进行扩大繁殖育种即为原种，原种一般采用广口瓶或袋装。
配方一木屑麸皮培养基
阔树木78%麸皮20%糖1%石膏粉1%水65%PH值自然
配方二棉籽壳木屑混合培养基
棉籽壳90%糖1%麸皮5%过磷酸钙3%石膏粉1%PH值自然
2．拌料与装袋
选用新鲜无霉变原料，根据生产所需的数量，计算配料总量，将麸皮、石膏粉均匀的混合在培养料里，糖和过磷酸钙溶于水解后，按上述干料量加入水，比例为1： 1、3拌匀，培养料含水量60%为宜，含水量以手紧握培养料指缝间有水欲滴为宜。堆闷30分钟后，装瓶(袋)。用机械或人工装袋稍加压实。(塑料袋规格通常为9*21*0、04即，而袋宽9厘米，长21厘米，单层厚4厘米)实，在袋口外套入塑料环，形成象瓶子一样，然后在袋口内塞松紧适宜棉塞、或用牛皮纸包扎好。
原种灭菌方法有两种，高压灭菌和常压灭菌。高压灭菌又称加压蒸气灭菌，灭菌原理：在高温(120℃)、高压(1公斤/厘米2)条件下灭菌2-3小时，将芽孢在内的微生物全部杀死。常压灭菌称流通蒸气灭菌，由于灭菌设备、条件和基本因素的不同，温度变动在 90-103℃之间，其热力、穿透力不强，在一定温度下维持足够时间达到灭菌目的，通常在100℃下维持8-10小时。
4．接种与培养
不论用接种箱或接种室接种，在接种前，需对接种箱或接种室用0、2%的来苏水或漂白粉进行消毒处理，然后将灭菌过的料瓶(袋)放入接种箱内或接种室内，用紫外线灯照射30分钟后，在无菌条件下进行接种，或在接种前用烟雾剂密闭薰蒸消毒。即烟雾剂点燃消毒时应关闭门窗。接种室消毒，一间房需点燃3盒50克规格烟雾剂；接种箱消毒每次仅用重量为40克，但又细分为20包的其中2包点燃即可(每包2克)。一般18×180厘米，母种试管每支可接4—6瓶(袋)原种。将接种后的菌种瓶(袋)放入发菌室培养。以培养室温度22-26℃，相对湿度为80%以下，光线为弱散射光，发菌期间应保持良好的通风条件。原种从接种到菌丝长满瓶(袋)需30—40天。
(三)栽培种制备
原种进一步扩繁，即为栽培种。栽培种一般采用塑料袋制备，规格为15×33×0、05，用无棉盖体封口。一瓶原种可接50瓶(袋)栽培种。栽培种培养基配方及拌料、装袋、灭菌、接种、发菌管理与原种用塑料袋制备时一致。
(四)菌种质量鉴定
菌种质量不仅与能否成功发菌有关，也关系到产量和效益，从事木耳栽培必须严把质量关。菌种的质量鉴定有两个方面的含义：一是分离培养的菌种是否是栽培所需种类。二是菌种是否为优良菌株。黑木耳菌种正常菌丝应洁白，生活力旺盛，发菌培养45天后，瓶(袋)间自上而下会出现菊花状或梅花型胶质原基，颜色明褐至黑褐色。如果瓶(袋)底积淡黄色液体，或上半部出现黄色粘液，培养基收缩，为过期老化菌种，应予淘汰。
如果菌种菌丝仅发至瓶(袋)1/3-1/2处时出现淡黑色的胶状耳基，说明菌种早熟，或扩大次数太多，或由于培养室光线过强。若菌丝只长一个角落而不蔓延，可能是培养基太干、过湿或干湿不均引起。若菌丝蔓延停止不前，并有一明显抑制线，多为杂菌所致。在发菌过程中，发现杂菌应及时检出不用。
