摘要
研究了放射性受体免疫分析方法在检测蒲烧烤鳗和白烧烤鳗中的氯霉素残留的应用。建立了烤鳗检测的制样、控制点设定的方法。二种方法可分别筛检10ppb和0．3ppb的氯霉素药物残留。
关键词 放射免疫 受体分析方法 烤鳗氯霉素残留
2002年初以来，随着我国出口的蜂蜜及水产品在欧盟被检出氯霉素残留，各进口国对我国出口的动物源性食品的药残要求越来越高。美国、日本也都相继提出了对药物残留的限量要求。福建省为我国最大的烤鳗出口基地，输往日本和美国的烤鳗都被要求检测氯霉素残留。日本的对氯霉素的限量要求为10μg／Kg，美国现为1gμg／Kg，正向0．3μg／Kg过渡。目前在我国各食品分析实验室中最常用的筛检方法是气相色谱分析方法和酶标分析方法。这两种方法都可定量，但存在样品处理耗时、繁琐的问题。另外，蒲烧烤鳗复杂的调味酱油成份也对色谱分析造成干扰。
CharmⅡ分析系统，是采用放射性受体竞争免疫的原理研制的抗生素残留的快速筛检系统，在美国、加拿大广泛用于牛奶及禽肉、家畜肉、鱼肉中的药物残留检测。近一、二年才引入中国市场，但厂方提供的方法和控制点都是用于测定新鲜组织中的药物残留。对加工、熟制过的产品未提供方法。为了适应目前出口产品的检测需要，我们将此方法在烤鳗中的应用进行了研究，建立了蒲烧烤鳗和白烧烤鳗的氯霉素残留的放射性受体免疫分析方法。
1材料与方法
1．1仪器
CharmⅡ7600放射性受体免疫分析系统(美国Charm公司生产)；离心机(3．3X1000rpm)；孵育器(80±2℃；50±1℃)；涡旋混合器；
1．2试剂
1．2．1提取缓冲液
1．2．2缓冲液M2
1．2．3200ppb的氯霉素标准品
1．2．4阴性组织提取物
1．2．5检测试剂：包括受体试剂片和经H3标记的氯霉素片剂。
以上试剂均由Charm公司试剂盒提供。
1．3分析方法
1．3．1分析原理测定的基础是竞争性受体免疫反应。用［3H］标记的氯霉素(示踪剂)与样品中的氯霉素竞争结合试剂(受体)上的氯霉素结合位点，当样品中残留有氯霉素时，残留物与受体上的结合位点结合，从而阻止了［3Ｈ］标记的氯霉素与结合剂位点的结合，未结合的［3Ｈ］标记的氯霉素被活性碳吸收(方法一)，或经离心后留在溶液中(方法二)。样品中的氯霉素含量越高竞争的结合位点越多，［3Ｈ］标记的氯霉素则越少，用CharmⅡ分析仪测定样品中的［3Ｈ］含量的cpm(每分钟脉冲数)值，cpm值越低则样品中的氯霉素残留量越高。
根据检测限要求的不同，采用两种试剂盒方法。
方法一：适用于检测10ppb和5ppb的氯霉素残留。反应使用三种试剂：［3Ｈ］标记的氯霉素(示踪剂)；结合试剂(受体)和活性碳。当结合剂被加入样品中后，如样品中含有氯霉素残留物，则与结合剂的结合位点(受体)结合，从而阻止了［3Ｈ］标记的氯霉素与这些位点的结合，用活性碳吸收没有结合的［3Ｈ］刚标记的氯霉素，离心后测定上层溶液中的［3Ｈ］含量的cpm值。
方法二：适用于检测<0．3ppb的氯霉素残留。反应使用二种试剂：［3Ｈ］标记的氯霉素(示踪剂)；结合试剂(受体)。当结合剂被加入样品中后，如样品中含有氯霉素残留物，则与结合剂的结合位点(受体)结合，从而阻止了［3Ｈ］标记的氯霉素与这些位点的结合，离心后取下层沉淀物测量其［3Ｈ］含量的cpm值。
1．3．2样品处理由于鳗鱼的脂肪含量相对较高，脂肪会影响检测效果，因此应尽量去除脂肪。而为避免干扰，蒲烧烤鳗的酱油要用刀尽可能地刮除干净。取烤鳗的鱼肉部分用均质器搅碎。注意：样品应冷冻保藏，避免微生物污染。
1．3．3残留物提取在50mL离心管内称取10g(检测限为10ppb)或20g(检测限为5ppb和0．15ppb)搅碎的鱼肉，加入提取缓冲液至40mL刻度。盖上离心管盖，上下强力振荡10分钟。将离心管放入孵育器(2℃)孵育45或30分钟，取出置碎冰中冰浴10分钟。3．3x1000rpm离心10分钟。再置于冰箱或冰块中冷冻5-10分钟取出，尽快将上层凝固的脂肪层去除，吸出上层液用缓冲液M2调整pH至7．5，待检。
1．3．4测定步骤
(1)方法一(10ppb及5ppb检测限)测定步骤：取一洁净的硼硅玻璃管(Charm公司提供)，加入一片受体试剂片(白色)再加300uL去离子水，在涡旋混合器上振荡10秒至药片破碎。用加样器加lmL样品到试管内。(每一样品用一新加液吸嘴)加入［3Ｈ］标记的氯霉素示踪剂(绿色)药片。用振荡器振荡大约10秒后，加入第一个活性碳黑药片。再用振荡器振荡大约10秒，置0℃~4℃冰浴5分钟。再加入入第二个活性碳黑药片。用振荡器振荡大约10秒。1750g(1EC离心机3．3x1000rpm)离心3分钟。用吸液器吸取300μL上清液到一个新的硼硅玻璃试管内(不要混入沉淀物)。加入3mL闪烁液，加盖、混匀。将试管放入CharmⅡ／7600分析仪内。按CharmⅡ／7600分析仪操作程序选项(检测控制点需预先设定并输入仪器，见1．4)，读［3Ｈ］刚项的cpm值。结果报告打印：样品的cpm值与控制点比较以确定阳性或未检出：样品cpm>控制点为未检出；cpm，<控制点为阳性。如果样品为阳性，重复测试阴性对照和阳性对照，以确定阳性结果。
(2)方法二(0．3ppb检测限)测定步骤：将一片受体试剂片(白色)加入一洁净的硼硅玻璃试管内，加300μL蒸馏水到试管内用涡旋混合器振荡10秒至药片破碎。用加样器加5mL样品到试管内。(每一样品用一新加液吸嘴)。用振荡器振荡大约15秒，使样品上下15次。置50±l℃孵育器内，孵育3分钟后，从孵育器内取出，混合15秒使样品上下15次。再置50±1℃孵育器内3分钟，取出试管，将［3Ｈ］标记的氯霉素示踪剂(绿色)药片加入试管内，置50±l℃孵育器内，孵育3分钟。1750g(IEC离心机3．3x1000rpm)离心3分钟。离心停止后立即取出试管，倒掉上层液(延迟倒上层液，可能会使沉淀的提取物滑出试管)，加300μL蒸馏水到试管内，将沉淀物破碎。加3mL闪烁液到试管内混匀。上机测试，测试方法与“方法一”才目同。
(3)阳性结果的确定：样品的cpm，<控制点时，需要重新检测样品及同时测定一个阴性对照和一个阳性对照，以确定试剂和设备是否工作正常。通常情况下：测试的阴性对照应该是阴性对照平均值±20％(每一试剂盒都会给出阴性对照平均值，平均值一般为运行三份阴性对照液的cpm值的平均数)；测试的阳性对照应该小于控制点。符合以上条件则样品的阳性结果成立。
1．3．5控制点建立
由于厂方试剂盒提供的控制点是采用新鲜鱼组织建立的，因此需要重新设立适用于烤鳗的控制点。其方法是：根据操作说明，选用无氯霉素残留的蒲烧烤鳗或白烧烤鳗(先经气—质方法检测确认无氯霉素残留)各取六份，按1．3．1方法处理样品。根据检测限要求称取10g(检测限为10ppb)或20g(检测限为5ppb，或0．15ppb)，加入测试所要求的抗生素浓度(可参照试剂盒说明书)，按照分析程序运行(“方法一”与“方法二”测定步骤)。得出6个cpm值，计算其平均值。在平均值上加上平均值的20％即为样品的控制点。
2结果与分析
2．1蒲烧鳗不同样品处理方法对cpm值(每分钟脉冲数)的影响：取6份蒲烧鳗，分两种方法制备样品：(1)未经处理直接取样。(2)去除酱油和油脂后取样。按“方法二”测定，控制点cpm为“1243”比较两种方法的cpm值，结果如表1。表1两种处理方法的比较试验对两组结果减去控制点后所得数据进行方差分析，因F=33．338>10．04=F0.01(1，10)，故证明两种不同处理方法对实验结果有显著影响。未经处理去除酱油和油脂的样品易出现假阳性。2．2加标验证试验：取6份烤鳗样品，加入0．3ppb含量的氯霉素标准品，分别测定加标前与加标后的cpm值，进行验证试验，结果见表2。表2加标验证试验加标验证结果的符合率为100％。
2．3实测结果分析：用ChafmⅠⅠ7600放射免疫分析仪，对271份烤鳗样品进行氯霉素检测，检出阳性样品8份，其中>10ppb的两份； 0．3ppb的6份。阳性结果经GC-MS方法确认，>10ppb的两份样品均为阳性，因此“方法一”的阳性符合率为100％。>0．3ppb的6份样品中有1份为假阳性，因此“方法二”的阳性符合率为87．5％，假阳性率为12．5％。两种方法均任取6份阴性结果用GC-MS确认，符合率均为100％，假阴性率为0％。
3结论
样品经去除酱油和油脂处理后，用放射免疫受体分析方法检测烤鳗中的氯霉素残留，方法可靠，灵敏性高，不会出现假阴性结果。同时此方法，快速、易于操作，可在2个小时内出结果。尤其适合于，烤鳗加工业的质量控制和出入境检验检疫机构的快速通关要求。本实验室近1年的实际应用证明此方法特异性强、可靠，尤以检测限为10ppb的方法应用至今从未发现有假阳性和阴性结果。但检测限为0．3ppb的方法，因其灵敏度过高，易出现假阳性结果。
