草甘膦从诞生之初就不是见佛杀佛的除草剂，相当一部分杂草对它具有天然耐性，如茴麻、水苋、蔾、竹节花、白酒草、铁荸荠、马唐、番薯、地肤、蓼、佛罗里达马蹄莲、费氏狗尾草、大果田菁、繁缕、龙葵。如果种植的作物伴生着这些杂草，放弃用草甘膦吧。
在40多年的发展过程中，更多的曾经在草甘膦面前不堪一击的“娇弱”杂草进化成功，让草甘膦无可奈何。代表性杂草即通泉草、鸭跖草、黄鹌菜、马齿苋、鼠曲草、铁苋菜、田旋花、苣荬菜，等等，其共性在于对草甘膦非常不敏感，耐药性强，单一使用草甘膦不能有效防除。我国分别于2006年、2010年报道了小飞蓬、牛筋草对草甘膦产生抗性，尤其是牛筋草已经在我国南方免耕种植区、种植园成为优势杂草和恶性杂草，其抗性蔓延日趋严重，成为难以解决的问题。
抗药性问题是无可避免的，目前混配施用是一个不错的对策。
与茎叶处理除草剂的混用。草甘膦对一些多年生草如苣荬菜、飞廉、问荆等的防效不理想。在生产上与苯氧羧酸类除草剂如2，4-滴等混用，不仅对小飞蓬等恶性杂草防治效果好，而且能提高对莎草、阔叶杂草的防治效果。
与土壤处理除草剂的混用。草甘膦的土壤活性较低，只能有效防除出土的杂草。而生产上的杂草一般是点片、陆续发生，不断造成危害。针对这一个问题，可以将草甘膦与一些土壤处理活性高的除草剂混用。这样“一杀一封”既能显着延长除草剂的持效期，又可以节约重复施药成本，减轻杂草危害。
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