20世纪对光合作用的探讨，向着物理学和化学两个方面不断深入。1905年英国植物学家F.F.布莱克曼提出光合作用包括需要光照的“光反应”和不需光照的“暗反应”两个过程，二者相互依赖，光反应时吸收的能量，供给暗反应时合成含高能量的多糖等的需要。20年代，O.瓦尔堡进一步提出在光反应中不是温度而是光的强度起作用。1929～1931年荷兰微生物学家C.B.范尼尔通过比较生化研究，发现光合硫细菌与绿色植物一样，也进行光合作用。只是绿色植物的供氢体是水，而光合硫细菌的供氢体是硫化氢或其他还原性有机物。C.B.范尼尔的工作改变了长期以来认为光合作用一定要放氧的看法，扩大了光合作用的概念，对以后有深远影响。对于光合作用的重要参与物质叶绿素，早就引起人们的注意。德国化学家R.M.维尔施泰特经过了8年的努力,于1913年阐明了叶绿素的化学组成。另一位德国化学家H.菲舍尔于1940年确定了它的结构，这些都为50年代“光合作用中心”的提出，以及色素吸收光子、能量传入作用中心等的发现奠定了基础。虽然光合作用的部位早就被认为是叶绿体，但真正用实验加以证实则在20世纪30年代末40年代初。英国植物生理学家R.希尔用离体叶绿体作实验,测到放氧反应,这是绿色植物进行光合作用的标志。但是否代表光合作用未能肯定。希尔称它为叶绿体的放氧作用，亦被称为“希氏反应”。这一工作直到1951年才被证实是光合作用的一部分。1954～1955年，美国生物化学家D.I.阿尔农美国微生物学家M.B.艾伦又证明离体叶绿体不仅能放氧，而且也能同化二氧化碳。这也就证实了叶绿体确是光合作用的部位。
美国伯克利加州大学的M.卡尔文、A.A.本森、J.A.巴沙姆等，利用劳伦斯实验室制备的同位素的和其他新的生化技术，花了10年的时间于50年代中期阐明了“光合碳循环”,或称“卡尔文循环”的过程。他们证明,在叶绿体内一种 5碳糖起了二氧化碳接收器的作用经过一系列的酶促反应，不断地循环同化二氧化碳，形成一个一个的6碳糖，再聚合成蔗糖或淀粉。
光合磷酸化是光合作用中的重要的能量传递过程。1954年D.I.阿尔农在用菠菜叶绿体研究二氧化碳同化的同时，发现叶绿素受光的激发产生电子，在传递过程中与磷酸化偶联,产生ATP,电子仍回到叶绿素分子上,继续上述过程，这一过程被称为循环光合磷酸化。几乎同时别人也证明，细菌中也存在着类似的过程。1957年D.I.阿尔农等又发现另一类型的光合磷酸化。在这个过程中，光使叶绿素从水中得到电子，电子传递过程中与希尔反应偶联，还原辅酶Ⅱ，放氧，同时产生ATP,这一过程称为非循环光合磷酸化。
光合作用中两个光反应系统的发现推动了光合磷酸化研究的不断深入。这项工作主要是美国植物生理学家R.埃默森及其合作者从40年代初到他逝世这十几年内进行的。1943年他们发现红光波段中,短波(～650纳米)区比长波区 (～700纳米)的光合效率高。1957年他们又发现两者同时照射比单一照射所产生的光合效率高。根据他们的工作以及其他人的工作，英国的R.希尔等提出可能存在着两个光反应系统:系统Ⅰ由远红光(～700纳米)激发,系统Ⅱ则依赖于较高能的红光（～650纳米）。非循环光合磷酸化对此就是一个有力的支持事例。根据这一设想及大量实验结果，设计出一个“Z图解”,表达两个光反应系统的协同作用，得到了广泛的支持。由此掀起了研究两个光反应系统结构与功能的热潮，推动了光合作用的核心问题──原初反应和水的光解问题的研究。
进入80年代，光合反应中心的结构研究取得了重要突破，1982年西德生化学家H.米舍尔成功地分离提取出生物膜上的色素复合体，即光合反应中心。以后德国的蛋白质晶体结构分析专家R.休伯和J.戴维森,经过4年的努力，用X射线衍射分析的方法,测定出这个复合体的复杂的蛋白质结构。这一成果在光合作用研究上是一个飞跃，有力地促进了太阳光能转变为植物能的瞬间变化原理的研究。
